背景簡介

CD4+T細胞指的是表面有CD4分子的T淋巴細胞，是外周淋巴組織中的初始T細胞在受到抗原攻擊后分化產生的一種效應T細胞，主要通過產生細胞因子參與細胞免疫。

作為淋巴細胞的主要組分，CD4+T細胞具有多種生物學功能，如產生多種細胞因子直接殺傷靶細胞，調節(jié)B細胞活化并產生抗體，并與其它的免疫細胞細胞共同協(xié)作，保護機體免受病原體以及腫瘤的侵害。

細胞基本信息

細胞名稱：小鼠脾臟CD4+T細胞

分離方法：磁珠分選

組織來源：C57小鼠脾臟

細胞形態(tài)：圓形、淋巴母細胞樣

生長特性：懸浮生長

細胞形態(tài)

小鼠CD4+T細胞是一種懸浮細胞，細胞形態(tài)呈圓形，細胞可傳5代左右；3代以內狀態(tài)最佳。

小鼠脾臟CD4+T細胞特點

1.免疫識別

在CD4共受體和T細胞受體(TCR)-CD3復合物的共同作用下，TCR識別抗原MHC II復合體，同時在細胞因子的作用下，CD4+T細胞增殖活化并發(fā)揮免疫學功能;

2.細胞殺傷

通過分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子促進CD8+T細胞的增殖和顆粒酶的釋放或直接殺傷腫瘤細胞，從而更有效的發(fā)揮腫瘤免疫功能;

3.可分化為多個亞群

CD4+T細胞具有極強的可塑性，其可極化為Th1、Th2、Th17和Treg細胞等效應細胞，從而在疾病中發(fā)揮不同作用;

4.免疫調節(jié)功能

除了促進CD8+T細胞活化外，在CD4+T細胞產生的多種細胞因子中，IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子也是調節(jié)B細胞、NK細胞等細胞活化的關鍵細胞因子

5.免疫記憶功能

CD4+記憶T細胞機體受到病原體的二次侵入時，可在抗原提呈細胞的作用下再次增殖分化，從而更快速的發(fā)揮免疫殺傷作用。

小鼠脾臟CD4+T細胞分離培養(yǎng)步驟

材料準備

工具：4-6周C57小鼠、小鼠CD4+T 細胞分選試劑盒 、紅細胞裂解液、眼科鑷、眼科剪、細胞篩網、PBS緩沖液、小鼠脾臟CD4+T 細胞專用培養(yǎng)基

提前開啟紫外線照射超凈臺30min：將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化，使用前室溫中預溫10-30 min。HBSS緩沖液緩沖液預冷，紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺，超凈臺通風10 min以上。

培養(yǎng)瓶：準備25cm2的培養(yǎng)瓶。

操作步驟

1.處死小鼠，無菌取出脾臟，在70 μm 細胞篩網上研磨脾臟，以預冷的PBS沖洗細胞篩網，收集細胞懸液于 50 mL 離心管中，500 g，離心5 min。

2.離心結束，棄上清，加入5 mL紅細胞裂解液(ACK)，室溫裂解5 min，再加入20 mL PBS，500 g， 離心5 min。

3.將脾細胞重懸于PBS，細胞懸液用70 μm 細胞篩網過濾后，計數，調整細胞密度為1×108 cells/mL。

4.按照每100 μL 細胞懸液(1×107個細胞)對應2 μL Biotin-Antibody Mix加入無菌流式管底部，混勻后 4°C 孵育10 min。

5.孵育完成后，在流式管中加入 20 μL Streptavidin磁珠 (1×107個細胞)(使用前渦旋振蕩重懸磁珠，確保磁珠完 全重懸)，混勻后4°C 孵育10 min。

6.孵育完成后，在流式管中加入2.5 mL分選buffer，用移液器上下混合吹打5次混勻(避免劇烈振蕩或者 上下顛倒混勻)。

7.將含有細胞的流式管置于磁力架上，靜置5 min。將細胞懸液輕柔倒入一個無菌離心管中(傾倒過程中流式管不要脫離磁力架)，此細胞懸液中即包含 純化的小鼠CD4+T細胞，500 g，離心5 min。離心后棄上清，收集細胞， 將細胞重懸于培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)擴增。

細胞標志物鑒定

CD4是CD4+T細胞重要的標記物,也是識別CD4+T細胞最可靠的標志。

小鼠脾臟CD4+T細胞培養(yǎng)注意事項

輕輕吹打T25細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基使細胞懸浮。

吸取培養(yǎng)瓶中所有培養(yǎng)基，在離心機中以1000轉離心5分鐘。

棄去上清，加入新的培養(yǎng)基重懸，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

建議1：2傳代。

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。

收集細胞及細胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。

根據細胞數量加入專用的淋巴細胞凍存液，使細胞密度5x106~ 1x107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。

將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。

小鼠脾臟CD4+T細胞研究應用

研究

CD4+T細胞是人體中最重要的T細胞亞群之一，并且可進一步?細分為更多亞群，其功能的發(fā)揮主要依靠產生多種細胞因子作用于不同的細胞，?在保護機體免受病原體和腫瘤侵害方面發(fā)揮重要的調節(jié)作用。?

實驗研究：通過分離培養(yǎng)CD4+T細胞并檢測其產生的細胞因子類別以便于在體外研究誘導CD4+T細胞活化及其引起炎癥反應的分子機制，從而通過藥物等方法調節(jié)CD4+T細胞活力以達到治療疾病的目的。

應用

TIL（腫瘤浸潤淋巴細胞）療法

?從患者體內提取腫瘤組織中的T細胞，?并在實驗室中擴增和改造，?使其能夠更有效地識別和攻擊癌細胞，目前已有研究表明通過使用改造后的CD4+T細胞的TCR療法顯著消除了患者腫瘤。

TCR（T細胞受體）療法

通過提取患者的CD4+T，?并在其中加入一個可以表達T細胞受體的基因，?使T細胞產生特異性的T細胞受體，?從而能夠更加有效的發(fā)揮CD4+T細胞功能，目前對于CD4+T細胞改造的應用已取得一定成效。

CAR-T（嵌合體抗原受體T細胞）療法

?從患者組織中提取T細胞，?通過基因改造加入一種制造嵌合體抗原受體的基因，?使改造后的T細胞能夠特異性地識別和殺傷靶細胞，雖然目前對于CAR-T療法的研究以CD8+T細胞為主，但CD4+T細胞在CAR-T療法中的作用也越來越受到關注。