背景簡(jiǎn)介

T淋巴細(xì)胞是來(lái)源于骨髓的多能干細(xì)胞，在骨髓中由其前體細(xì)胞產(chǎn)生，隨后遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細(xì)胞。

作為淋巴細(xì)胞的主要組分，T細(xì)胞具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，是身體中抵御各種病原微生物感染、抑制腫瘤形成的“斗士”。

基本信息

細(xì)胞名稱：小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞

分離方法：磁珠分選

組織來(lái)源：C57小鼠

細(xì)胞形態(tài)：圓形、淋巴母細(xì)胞樣

生長(zhǎng)特性：懸浮生長(zhǎng)

小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞特點(diǎn)

1.細(xì)胞殺傷

與靶細(xì)胞特異性結(jié)合，通過(guò)釋放顆粒酶，穿孔素等，破壞靶細(xì)胞膜，直接殺傷靶細(xì)胞;

2.免疫應(yīng)答

通過(guò)細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體，識(shí)別抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原，從而發(fā)揮免疫學(xué)功能;

3.調(diào)節(jié)B細(xì)胞分化

分泌細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)或縮氨酸用來(lái)調(diào)控其它的免疫細(xì)胞;如白介素，可以使得B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞;

4.免疫記憶功能

機(jī)體受到病原體的二次侵入時(shí)，記憶T細(xì)胞可更加迅速的再次破壞靶細(xì)胞即受病菌或病毒感染的細(xì)胞，釋放出靶細(xì)胞中的抗原

5.產(chǎn)生細(xì)胞因子

T淋巴細(xì)可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如干擾素、轉(zhuǎn)移因子、白細(xì)胞介素等，這些淋巴因子，具有殺傷腫瘤細(xì)胞，刺激造血組織，對(duì)抗化療副作用等功能。

小鼠脾臟CD3+T淋巴原代細(xì)胞分離培養(yǎng)操作步驟

材料準(zhǔn)備

4-6周C57小鼠、BeaverBeads? 小鼠 CD3+T淋巴細(xì)胞分選試劑盒 、紅細(xì)胞裂解液、眼科鑷、眼科剪、細(xì)胞篩網(wǎng)、PBS緩沖液、小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞專用培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基和緩沖液

將培養(yǎng)基和添加劑置于室溫，使用前室溫中預(yù)溫10-30 min。HBSS緩沖液緩沖液預(yù)冷，紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺(tái)，超凈臺(tái)通風(fēng)10 min以上。

培養(yǎng)瓶

準(zhǔn)備25cm2的培養(yǎng)瓶

小鼠脾臟CD3+T淋巴細(xì)胞操作步驟

1.將小鼠脫頸處死，在75%乙醇中浸泡5min，使用剪刀打開(kāi)小鼠腹腔，取出小鼠脾臟，使用PBS沖洗兩遍。

2.在70μm細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的PBS 沖洗細(xì)胞篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液于 50 mL離心管中，500 g，離心5 min。

3.離心結(jié)束，棄上清，加入5 mL紅細(xì)胞裂解液(ACK)，室溫裂解5 min，再加入20 mL PBS，500 g， 離心5 min。

4.將脾細(xì)胞重懸于PBS，細(xì)胞懸液用70 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108 cells/ml。

5.按照每100 μL 細(xì)胞懸液(1×107個(gè)細(xì)胞)對(duì)應(yīng)2 μL Biotin-Antibody Mix加入無(wú)菌流式管底部，混勻后 4°C 孵育10 min。

6.孵育完成后，在流式管中加入 20 μL BeaverBeads? Streptavidin (1×107個(gè)細(xì)胞) (使用前渦旋振蕩重懸磁珠，確保磁珠完 全重懸)，混勻后4°C 孵育10 min。

7.孵育完成后，在流式管中加入2.5 mL 分選buffer，用移液器上下混合吹打5次混勻(避免劇烈振蕩或者 上下顛倒混勻)。

8.將含有細(xì)胞的流式管置于磁力架上，靜置5 min。將細(xì)胞懸液輕柔倒入一個(gè)無(wú)菌離心管中(傾倒過(guò)程中流式管不要脫離磁力架)，此細(xì)胞懸液中即包含 純化的小鼠CD3+T細(xì)胞，500 g，離心5 min。離心后棄上清，收集細(xì)胞， 將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)擴(kuò)增。

磁珠陰選

小鼠脾臟CD3+T淋巴原代細(xì)胞流式鑒定

CD3是成熟T細(xì)胞的標(biāo)記物,是識(shí)別CD3+T細(xì)胞最可靠的標(biāo)志，此外，也可通過(guò)檢測(cè)TCR來(lái)識(shí)別CD3+T細(xì)胞。

小鼠脾臟CD3+T淋巴原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

輕輕吹打T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基使細(xì)胞懸浮。

吸取培養(yǎng)瓶中所有培養(yǎng)基，在離心機(jī)中以1000轉(zhuǎn)離心5 min。

棄去上清，加入新的培養(yǎng)基重懸，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

建議1：2傳代。

待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5x106~ 1x107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1 mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。

小鼠脾臟CD3+T淋巴原代細(xì)胞研究應(yīng)用

CD3+T細(xì)胞可代表成熟的T淋巴細(xì)胞在抗腫瘤治療中?T細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，?通過(guò)識(shí)別和攻擊被感染的細(xì)胞或異常細(xì)胞，?在保護(hù)機(jī)體免受病原體和腫瘤侵害方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

實(shí)驗(yàn)研究

通過(guò)分離T淋巴細(xì)胞可用于在體外研究T淋巴細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)的機(jī)制，從而通過(guò)藥物等方法抑制T細(xì)胞活力緩解患者自身的免疫病理?yè)p傷。

TIL（腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞）療法

?從患者體內(nèi)提取腫瘤組織中的T細(xì)胞，?并在實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增和改造，?使其能夠更有效地識(shí)別和攻擊癌細(xì)胞。

TCR（T細(xì)胞受體）療法

?通過(guò)提取患者的T細(xì)胞，?并在其中加入一個(gè)可以表達(dá)T細(xì)胞受體的基因，?使T細(xì)胞產(chǎn)生特異性的T細(xì)胞受體，?從而能夠追蹤并殺死癌細(xì)胞。

CAR-T（嵌合體抗原受體T細(xì)胞）療法

?從患者血液中提取T細(xì)胞，?通過(guò)基因改造加入一種制造嵌合體抗原受體的基因，?使改造后的T細(xì)胞能夠特異性地追蹤并殺死癌細(xì)胞。