786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞背景介紹

786-O細(xì)胞源自一個原發(fā)性透明細(xì)胞癌。此細(xì)胞有微絨毛和橋粒，能在軟瓊脂是生長。 此細(xì)胞生成的一個PTH樣的多肽與乳癌和肺癌中的肽相似。這個多肽的N端與PTH相似，活性與PTH相似，分子量為6000道爾。786-O細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

786O細(xì)胞形態(tài)特征

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：786-O，人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：786-o; 786O; 786-0; 786.O; 786-O RCC; RCC 786-O; RCC_7860; RCC 7860; 7860; 786-0WT;人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞

種屬來源：人

年齡性別：男;58歲

組織來源：腎;腎細(xì)胞腺癌

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X，Y;CSF1PO：10;D13S317：8;D16S539：12;D18S51：13，14;D19S433：14，15;D21S11：29，30;D2S1338：17，18;D3S1358：16;D5S818：9;D7S820：11;D8S1179：13;FGA：24;TH01：6，9.3;TPOX：8，11;vWA：15，17;

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-1932 BCRC; 60243;中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心

培養(yǎng)基：1640+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

倍增時間：~24-45 hours

致瘤性：Yes, in immunosuppressed hamsters.

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴 75%酒精

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放 30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞傳代操作

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好786-O細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察786-O細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

4)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

7)將裝有786-O細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫 30 個 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

8) 確定786-O細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞培養(yǎng)技巧

顯微鏡下見786-O細(xì)胞,呈多角形或長梭形，貼壁生長,每3天傳代1次。以1:4比例傳代,細(xì)胞生長非?？?適時進(jìn)行換液,細(xì)胞密度過大時有部分細(xì)胞漂浮。

786-O細(xì)胞株對生長環(huán)境要求不是很高，培養(yǎng)難度不大，37℃、5%CO2、95%飽和濕度的孵箱中常規(guī)培養(yǎng),RP-MI1640 培養(yǎng)基加10%胎牛血清或新生牛血清均可。消化細(xì)胞時,應(yīng)在顯微鏡下觀察,大部分細(xì)胞變圓時停止消化,以免消化過度對細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞傳代可按1:4至1:12比例進(jìn)行,傳代細(xì)胞數(shù)量多則生長較快,根據(jù)具體情況傳代比例可在此范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。需要注意的是,培養(yǎng)任何細(xì)胞操作過程都必須做到無菌原則。所以,一般都在培養(yǎng)基里加青霉素、鏈霉素(均為100U/mL),可在一定程度避免細(xì)菌污染;另外,還要注意防止空氣中的霉菌污染。一般來講,細(xì)胞受到污染,培養(yǎng)基會過早變得偏堿性,顏色由原來的紅色變?yōu)榻瘘S色,顯微鏡下可見大量的細(xì)菌,并且有活躍的運動;簡便的處理辦法是徹底銷毀受污染的細(xì)胞,查清任何可能受污染的環(huán)節(jié)，并做相應(yīng)的處理。除此以外,也應(yīng)注意防止受到實驗室里的Hela細(xì)胞污染。鑒別方法有兩點:首先786-O細(xì)胞的染色體特征同Hela細(xì)胞的不同，尤其是Y染色體;其次是酶學(xué)上的不同，786-O細(xì)胞所含的葡萄糖6磷酸脫氫酶(G6PD)為B型，而后者為A型。786-O細(xì)胞在體外被穩(wěn)定地傳代培養(yǎng),是一株良好的實驗細(xì)胞模型。首先因為種屬是人,實驗研究可最大限度地接近人體實驗。另外,由于培養(yǎng)特性穩(wěn)定,使得科研人員精確地復(fù)制實驗條件成為可能。

786-O細(xì)胞在小鼠中是否成瘤

786-O是來源于人的腎癌細(xì)胞系，經(jīng)皮下成瘤檢測實驗表明該細(xì)胞系在皮下接種后，能正常成瘤。

786-O細(xì)胞成瘤性驗證

為驗證 786-O 細(xì)胞系能否實現(xiàn)皮下成瘤，我們設(shè)計了在 M-NSG 小鼠右側(cè)腋下接種一定量的 786-O 細(xì)胞，其成瘤結(jié)果說明：在皮下接種 786-O 細(xì)胞系能正常成瘤。如圖二所示：

圖二、 786-O 細(xì)胞系在M-NSG小鼠中的成瘤曲線(n=5)

小鼠體重變化曲線

在驗證 786-O 細(xì)胞系成瘤性的同時，為了從體重方面檢測該細(xì)胞系對小鼠是否有負(fù)面影響，我們也持續(xù)監(jiān)測了小鼠的體重情況，從結(jié)果來看，小鼠在整個成瘤過程中，整體體重呈先增長后下降趨勢，但小鼠精神狀態(tài)無明顯異常，期體重變化趨勢如圖三所示：

圖三、 786-O 細(xì)胞系在成瘤驗證過程中小鼠體重變化趨勢(n=5)

786-O人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞的應(yīng)用

786-O/786-0/人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞主要用于科研實驗研究，如有實驗探討PI3K-Akt信號通路PI3K抑制劑LY294002對786-O/786-0/人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。采用MTT法檢測LY294002對786-O/786-0/人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，倒置顯微鏡觀察不同濃度及時間點處理LY294002對786-O/786-0/人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響，Hochest染色檢測其對786-O/786-0/人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞凋亡的影響。MTT結(jié)果顯示LY294002對細(xì)胞增殖表現(xiàn)出顯著抑制(P0.05或P0.01，vs陰性)，并表現(xiàn)為藥物劑量和時間的依賴性，形態(tài)學(xué)顯示，相對于正常細(xì)胞，LY294002可以使細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，表現(xiàn)為體積縮小，突起變少等現(xiàn)象，Hochest染色結(jié)果顯示，隨著LY294002濃度的加大，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)凋亡小體進(jìn)而完成凋亡。結(jié)論PI3K抑制劑LY294002可明顯抑制786-O/786-0/人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)786-0細(xì)胞凋亡，并且呈現(xiàn)濃度依賴性變化。

人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞可以用于LY294002抑制PI3K/AKT信號通路對人腎透明細(xì)胞腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

應(yīng)用PI3K高特異抑制劑2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4氫-1-苯并吡喃-4-酮(LY294002)作用于人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系，探討LY294002對人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制，從而為其臨床治療的研究奠定基礎(chǔ)。

方法：

(1)人腎透明細(xì)胞癌786-0細(xì)胞系培養(yǎng)，建立細(xì)胞模型。

(2)將對數(shù)生長期的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞分組培養(yǎng)。用不同藥物濃度的LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)處理腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞,MTT法檢測癌細(xì)胞在不同的作用時間(24h、48h、72h)下的OD值，計算增殖抑制率,繪制腎癌細(xì)胞濃度-抑制率曲線及時間-抑制率曲線。用Hoechst染色法觀察腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞，經(jīng)LY294002(5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,40μg/mL)不同的作用時間(24h、48h、72h)下,細(xì)胞凋亡情況。

(3)采用RT-PCR法分別檢測LY294002在不同濃度及時間點對786-O細(xì)胞處理后細(xì)胞的PI3K、mTOR、Akt mRNA的表達(dá)情況，探討其對PI3K、mTOR、Akt mRNA表達(dá)的影響，及其對786-O細(xì)胞增殖的影響。

結(jié)果

(1)通過MTT法檢測LY294002在24、48、72h均表現(xiàn)出增殖抑制作用，當(dāng)LY294002濃度從1μg/mL增加到40μg/mL時，作用24h細(xì)胞抑制率從6%增加到55%，作用48h時，細(xì)胞抑制率從12%增加到78%，作用72h時細(xì)胞抑制率從14%增加到84%，同一時間不同濃度的各組細(xì)胞與陰性對照組相比，抑制率有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或0.01)，提示隨著LY294002濃度的增加，其抑制786-O細(xì)胞增殖的作用逐漸增加。用倒置顯微鏡下觀察LY294002用藥對786-O細(xì)胞生長及形態(tài)的影響，各濃度LY294002作用48h時細(xì)胞形態(tài)變化最為典型。結(jié)果顯示，相對于正常細(xì)胞，LY294002可以令細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，表現(xiàn)出濃度依賴性變化。正常細(xì)胞的形態(tài)整齊，邊緣清晰，細(xì)胞排列緊密，而隨藥物濃度的增加，藥物作用下細(xì)胞變圓漂浮無法正常貼壁，細(xì)胞固縮，細(xì)胞密度減少。

(2)通過Hoechst染色法在熒光顯微鏡下觀察對照組細(xì)胞核呈彌散均勻淡藍(lán)色的熒光;出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀亮藍(lán)色熒光;相對于未經(jīng)藥物處理的786-0細(xì)胞，1μg/mL的藥物處理48h后，細(xì)胞形態(tài)還未出現(xiàn)明顯的變化;2.5μg/mL藥物處理可見個別細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)凋亡小體;5μg/mL藥物處理染色質(zhì)熒光增強(qiáng)，出現(xiàn)凋亡小體的細(xì)胞增多;10μg/mL藥物處理可見凋亡前期的細(xì)胞進(jìn)一步增多;20μg/mL藥物處理可見凋亡小體突破細(xì)胞膜開始釋放;40μg/mL藥物處理可見大部分細(xì)胞凋亡小體釋放，完成凋亡。

(3)在LY294002處理細(xì)胞48h，采用1、2.5、5、10、20、30、40μg/mL濃度處理下，PI3K、Akt、mTOR mRNA的表達(dá)顯著受到抑制，并且呈現(xiàn)出隨藥物濃度的變化出現(xiàn)抑制程度增大的正比關(guān)系;細(xì)胞增殖實驗顯示隨著藥物濃度及其作用時間的延長，其抑制腫瘤作用逐漸增加。

786o細(xì)胞系moi范圍

786o 細(xì)胞系是一種來源于人類的腫瘤細(xì)胞系，常用于腫瘤研究和藥物篩選。在實驗室中，研究人員需要通過調(diào)整細(xì)胞密度來控制細(xì)胞系的生長，這就涉及到一個重要的參數(shù):moi。

moi，即細(xì)胞密度的倒數(shù)，是衡量細(xì)胞生長狀態(tài)的重要指標(biāo)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，moi的范圍會直接影響到細(xì)胞的生長狀態(tài)和實驗結(jié)果。對于786o細(xì)胞系，其moi范圍通常在0.1-10 之間。當(dāng) moi過低時，細(xì)胞密度過大，細(xì)胞之間的競爭激烈，容易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而當(dāng)moi過高時，細(xì)胞密度過低，細(xì)胞生長緩慢，會影響實驗的進(jìn)度和結(jié)果。因此，選擇合適的moi范圍對于 7860細(xì)胞系的生長至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，對于7860細(xì)胞系，最適合的moi 范圍在1-5之間。在這個范圍內(nèi)，細(xì)胞生長迅速，且細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，適合進(jìn)行各種實驗?？偟膩碚f，moi是控制細(xì)胞系生長的重要參數(shù)，對于7860細(xì)胞系，其最適合的moi范圍在1-5之間。

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