豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞背景介紹

豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞永生化通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。

子宮內(nèi)膜是指構(gòu)成哺乳類子宮內(nèi)壁的一層。子宮內(nèi)膜對(duì)動(dòng)情素和孕激素都起反應(yīng)，因此可隨著性周期(發(fā)情周期、月經(jīng)周期)發(fā)生顯著的變化。子宮內(nèi)膜覆蓋著粘膜，由粘膜上皮與其下方的固有層所組成。粘膜上皮為柱狀上皮、立方上皮或復(fù)層柱狀上皮，動(dòng)情素分泌時(shí)，各上皮細(xì)胞將長大、分裂使數(shù)目增多。

豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞形態(tài)特征

豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞永生化產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞永生化

種屬來源：豬

組織來源：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的正常子宮組織

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：鋪路石狀細(xì)胞，不規(guī)則細(xì)胞

細(xì)胞鑒定：廣譜角蛋白(PCK)或細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)免疫熒光染色為陽性。經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%，不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌

培養(yǎng)基：豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞永生化專用培養(yǎng)基

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞培養(yǎng)操作說明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞永生化專用培養(yǎng)基、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái) 30min，提前打開水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放 30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍，3mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞傳代操作

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

4)打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無菌離心管中。

7)將裝有豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

8) 確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

豬子宮內(nèi)膜上皮永生化細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×10⁶~1×10⁷/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80 度凍存盒里，放置 24 小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

子宮內(nèi)膜主要由上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞組成，不僅是一個(gè)保護(hù)性內(nèi)膜，而且是具有多種分泌功能的內(nèi)膜。胚胎著床階段是母豬懷孕后胎兒死亡的高峰期之一，而胚胎著床是與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞緊密相連的，所以對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，探討子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分離與體外培養(yǎng)條件、生長特點(diǎn)及其增殖過程，為進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在胚胎附置時(shí)的作用，提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

材料與方法

屠宰場(chǎng)采集卵泡期子宮，于切口處結(jié)扎，迅速放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。用75%酒精擦拭子宮外表面，PBS沖洗2-3遍。在超凈臺(tái)內(nèi)，沿子宮角縱向剪開，用PBS沖洗2次。用剪刀把子宮內(nèi)膜上皮組織剪成條狀，置PBS中沖洗，直至液體清亮，剪成1mm3的肉泥狀，接種于培養(yǎng)瓶，用0.1%膠原蛋白酶I，37℃水浴搖床消化2.5h，加入等量的終止液(含10%FBS胎牛血清的DMEM)終止消化。把消化液和終止液的混合液過100目細(xì)胞篩，濾液吸至離心管，500r/min離心5min，棄上清，沉淀用10mLPBS吹打懸浮。500r/min離心5min，棄上清。完全培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀吹打懸浮，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以2x10⁵個(gè)細(xì)胞/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第1次換液于2d后，以后隔2-3d更換培養(yǎng)液1次。培養(yǎng)到細(xì)胞幾乎聚合成片，大約需要5-7d時(shí)間。傳代培養(yǎng)時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，2mLPBS漂洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化3-5min，待大部分細(xì)胞變圓透亮懸浮時(shí)，立即加入等體積的終止液終止消化，吹打數(shù)次，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)入至離心管，1000r/min離心5min，棄上清，用5mLPBS吹打懸浮，1000r/min離心5min，棄上清，將細(xì)胞沉淀懸浮接種于新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

結(jié)果

豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)24h后基本已貼壁，并成漩渦狀排列的致密單層細(xì)胞集落，偶見散在的間質(zhì)細(xì)胞插入性生長。培養(yǎng)2d后，上皮細(xì)胞80%融合，呈梭形，邊界清楚，排列緊密，胞質(zhì)呈顆粒狀，胞核大而圓，核仁明顯，細(xì)胞集落擴(kuò)大并相互融合成片，培養(yǎng)液顏色變淡、變渾濁。培養(yǎng)第3d上皮細(xì)胞基本鋪滿25cm3的培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈梭形，生長旺盛，可以體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般可連續(xù)培養(yǎng)6代左右，之后細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，細(xì)胞變大，由梭形向成纖維狀轉(zhuǎn)變，集落漩渦狀向散在單個(gè)生長，貼壁及生長速度變緩。

討論

在豬子宮內(nèi)膜上皮組織獲取后，用膠原蛋白酶消化，把消化液和終止液的混合液過100目細(xì)胞篩過濾，濾液吸至離心管，500r/min離心5min，此時(shí)上清中主要為間質(zhì)細(xì)胞，沉淀主要為上皮細(xì)胞。在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞純化時(shí)，主要利用間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞貼壁的時(shí)間不一樣，巧妙的把兩種細(xì)胞分開。本研究建立的豬子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)方法，可在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，并可以體外培養(yǎng)，為研究子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在胚胎附置時(shí)的作用，提供了一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>