266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞簡(jiǎn)介

266-6于1985年從患有胰腺腺泡癌的小鼠胰腺中分離出來(lái)，采用彈性蛋白酶I/SV- 40T抗原融合基因誘導(dǎo)腫瘤。這些細(xì)胞保持部分分化的表型，并表達(dá)可檢測(cè)水平的一些消化酶mRNA。細(xì)胞對(duì)卡巴膽堿和膽囊收縮素有反應(yīng)，但對(duì)P物質(zhì)、分泌素或血管活性腸肽(VIP)無(wú)反應(yīng)。細(xì)胞帶有彈性蛋白酶I/新霉素轉(zhuǎn)基因。

266-6細(xì)胞類(lèi)型及特征

266-6細(xì)胞系具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，可以在培養(yǎng)條件下進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)。

它保留了部分分化的表型，并且表達(dá)多種消化酶mRNA，這使得它在研究胰腺腺泡癌的生理和病理過(guò)程中具有獨(dú)特的價(jià)值。

此外，266-6細(xì)胞系對(duì)卡巴膽堿和縮膽囊素等刺激物有反應(yīng)，但對(duì)P物質(zhì)、促胰液素或血管活性腸肽(VIP)沒(méi)有反應(yīng)，這一特性使得研究者可以通過(guò)不同的刺激條件來(lái)觀察和研究細(xì)胞的反應(yīng)。

266-6細(xì)胞形態(tài)

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞信息

細(xì)胞名稱(chēng)：266-6，小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞

種屬來(lái)源：小鼠

組織來(lái)源：胰腺

生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+PS

STR位點(diǎn)信息：Mouse STR 4-2：19.3,20.3;Mouse STR 5-5：14;Mouse STR 6-4：18;Mouse STR 6-7：12,17;Mouse STR 12-1：17;Mouse STR 15-3：22.3;Mouse STR 18-3：16;Mouse STR X-1：28

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CRL-2151;Ubigene; YC-C014

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞培養(yǎng)操作說(shuō)明

266-6細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1. 無(wú)菌環(huán)境：無(wú)菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2. 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2 培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色 0-10ul;黃色 20-200ul;藍(lán)色 100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm 皿、10cm 皿，培養(yǎng)瓶等。

4. 試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1. 無(wú)菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴 75%酒精

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1.準(zhǔn)備：紫外線(xiàn)照臺(tái) 30min，提前打開(kāi)水浴鍋設(shè)置 37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20 分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放 30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL 槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL 移液槍?zhuān)?mL 巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到 37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1 mL266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞 1min 內(nèi)融化，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻， 移入離心機(jī)中 100rpm 離心 3min，以 75%酒精噴凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用 3mL 巴氏管取 5mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 6cm 培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取 12mL 新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的 10cm 培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱(chēng)和細(xì)胞名稱(chēng)。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà) 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱過(guò)夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞傳代操作

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線(xiàn)照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍?zhuān)瑥U液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到 85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

4)打開(kāi)廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取 4ml 不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm 皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是 10cm 皿則取 8ml 1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

5)用廢液泵吸走 PBS 廢液，加1 mL消化液(0.25%Trypsin-0.02% EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化 1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入 CO2 培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6)用 1ml 移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸 1ml 移液槍移入無(wú)菌離心管中。

7)將裝有266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000 轉(zhuǎn)離心 3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取 1-2mL 新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà) 30 個(gè) 8 字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

8) 確定細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞傳代小貼士

1)一定要防止細(xì)胞過(guò)消化，因過(guò)消化，使細(xì)胞成團(tuán)，不均勻，且對(duì)細(xì)胞傷害很大，影響細(xì)胞貼壁和導(dǎo)致生長(zhǎng)狀態(tài)差等。

2)若在加入未經(jīng) 37℃溫育的胰酶(指僅為室溫)消化細(xì)胞時(shí)，即使細(xì)胞已經(jīng)變圓，且透亮，用完全培養(yǎng)基終止消化后仍很難吹打下來(lái)。那是因?yàn)橐让傅臏囟炔贿m宜，可把殘留有胰酶作用的培養(yǎng)皿放到 CO2 培養(yǎng)箱中，放置 2-3min，讓胰酶在其最佳溫度(37℃)下消化細(xì)胞。

3)用力吹打和氣泡產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞都有傷害，故應(yīng)輕柔吹打并盡量減少氣泡產(chǎn)生，吹打結(jié)束使細(xì)胞盡量分離成單個(gè)細(xì)胞。

4)一般 6cm 加完全培養(yǎng)基 5ml，10cm 培養(yǎng)皿加培養(yǎng)基 12-15ml，T25 瓶加培養(yǎng)基 8ml。

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1) 準(zhǔn)備工作：紫外線(xiàn)照臺(tái) 30min，準(zhǔn)備好細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出 37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時(shí)以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍?zhuān)瑥U液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞，在顯微鏡下觀察266-6細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá) 80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25 瓶為例

266-6小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液， 在細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期、培養(yǎng)用的 培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80 度凍存盒里，放置 24 小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

266-6細(xì)胞文獻(xiàn)引用及溯源

1967年始，迄今為止，關(guān)于小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞的文獻(xiàn)已有29篇。

266-6 cell line最早的一篇文獻(xiàn)R Rochford 1, L P Villarreal在1991年發(fā)表于ASM Journals，主要描述266-6細(xì)胞作為轉(zhuǎn)化的腺泡細(xì)胞系的代表。通過(guò)比較與正常胰腺細(xì)胞之間的差異，研究人員可以評(píng)估細(xì)胞特異性控制和增強(qiáng)子需求對(duì)于多瘤病毒(Py)DNA復(fù)制的影響。通過(guò)觀察266-6細(xì)胞中Py復(fù)制效率的變化，揭示Py病毒在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的復(fù)制機(jī)制，并與正常胰腺細(xì)胞的復(fù)制模式進(jìn)行對(duì)比，從而更深入地理解Py病毒的復(fù)制特性及其調(diào)節(jié)機(jī)制。

266-6細(xì)胞系應(yīng)用

266-6是一種重要的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。

在醫(yī)學(xué)研究中，266-6細(xì)胞系被廣泛用于研究胰腺腺泡癌的發(fā)病機(jī)理、藥物篩選以及治療方法的探索。通過(guò)對(duì)這種細(xì)胞系的研究，科學(xué)家們可以深入了解胰腺腺泡癌的生物學(xué)特性，為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供重要依據(jù)。

此外，由于266-6細(xì)胞系具有穩(wěn)定的生長(zhǎng)特性和可重復(fù)性，它也成為了研究胰腺腺泡癌基因表達(dá)和調(diào)控的重要工具。利用這種細(xì)胞系，研究者可以通過(guò)基因敲除、基因過(guò)表達(dá)等手段來(lái)觀察特定基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)、分化以及惡性轉(zhuǎn)化的影響，從而揭示胰腺腺泡癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。

266-6細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域

●胰腺腺泡細(xì)胞癌(ACC)是一種罕見(jiàn)的惡性腫瘤，由形態(tài)與腺泡細(xì)胞相似的細(xì)胞組成，并有證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞合成外分泌酶，占所有胰腺腫瘤的1%-2%。

●266-6細(xì)胞可以用來(lái)理解胰腺腺泡細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制、生物標(biāo)志物的開(kāi)發(fā)，以及化療、放射治療、靶向治療和免疫治療的評(píng)估和優(yōu)化。

●研究人員可以利用266-6細(xì)胞產(chǎn)生的酶的免疫組織化學(xué)標(biāo)記研究ACC的鑒別診斷，研究用于表征ACC的標(biāo)志物和進(jìn)行測(cè)序，例如確定胰腺ACC中多個(gè)潛在的可靶向遺傳改變。

●在診斷方面，266-6細(xì)胞可以構(gòu)建BALB/c品系小鼠移植瘤模型，利用CT和MRI對(duì)接種小鼠進(jìn)行掃描，可以準(zhǔn)確地描述ACC成像特征。

●在治療方面，荷瘤鼠模型可以用于研究胰腺腺泡細(xì)胞癌的分期、預(yù)后、預(yù)測(cè)因素、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移、治療等。

綜上所述，小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞系266-6是一種重要的實(shí)驗(yàn)工具，對(duì)于研究胰腺腺泡癌的發(fā)病機(jī)理、藥物篩選以及治療方法的探索具有重要意義。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和研究方法的不斷完善，相信這種細(xì)胞系將在未來(lái)的醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。

●細(xì)胞標(biāo)志物：包括但不限于CK8、CK18、嗜鉻粒蛋白、突觸素、BCL10等。

266-6細(xì)胞參考文獻(xiàn)

Kruse F, et al. The cell-specific elastase I enhancer comprises two domains [published erratum appears in Mol. Cell. Biol. 8: 1862, 1988]. Mol. Cell. Biol. 8: 893-902, 1988. PubMed: 3352608

Swift GH, et al. Differential requirements for cell-specific elastase I enhancer domains in transfected cells and transgenic mice. Genes Dev. 3: 687-696, 1989. PubMed: 2744460

Ornitz DM, et al. Elastase I promoter directs expression of human growth hormone and SV40 T antigen genes to pancreatic acinar cells in transgenic mice. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409, 1985. PubMed: 3006998