背景簡介

NK細胞又稱自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)，NK細胞形態(tài)上屬于大顆粒淋巴細胞，來源于骨髓，是除T細胞、B細胞之外的第三大類淋巴細胞，約占血液中所有免疫細胞(白細胞數量)的15%，屬于天然免疫系統(tǒng)的核心細胞。

NK細胞存在于大多數器官(骨髓、肺、淋巴結、外周血、脾臟和肝臟)。NK細胞也被描述在許多其他器官中，如腸、皮膚、膀胱、扁桃體、子宮、胸腺、腎臟、胰腺、脂肪組織，甚至在小鼠大腦中。

細胞形態(tài)

細胞特點

1. 免疫監(jiān)視

NK免疫細胞能高度識別、監(jiān)視體內細胞病變，防止超敏反應，執(zhí)行免疫監(jiān)視。

2. 清除病原體

防止鄰近的神經元相互干擾，且參與形成血—腦屏障，對物質的運輸有一定選擇作用。

3. 抗衰老

免疫細胞可誘導老細胞凋亡，促進信息報產生，提升精力、體力、延緩衰老。

4. 殺傷腫瘤細胞

NK 細胞是機體重要的免疫細胞，可靶向性殺傷腫瘤細胞，是未來治療腫瘤的體細胞。

實驗介紹

本實驗室采用獨有的細胞因子培養(yǎng)法，將外周血中的單個核細胞進行誘導。經過14天的誘導培養(yǎng)CD3-/CD56+NK細胞絕對數量可擴增達到1000倍，其純度可達80%以上

材料準備

儀器：離心機、顯微鏡、計數器、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

試劑：人外周血淋巴細胞分離液、清洗液、NK細胞基礎培養(yǎng)基、NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E。

耗材：10 mL移液管、15 mL離心管、采血管、T75培養(yǎng)瓶、T175培養(yǎng)瓶。

操作步驟

提前開啟紫外線照射超鏡臺30分鐘，超鏡臺通風10分鐘以上，水浴鍋提前開啟加熱至56℃，提前準備好移液管、T75培養(yǎng)瓶、人外周血淋巴細胞分離液、清洗液、NK細胞基礎培養(yǎng)基、因子、1 mL槍頭、200 μL槍頭、移液槍、15 mL離心管，提前從冰箱取出放置室溫。

(一)單個核細胞分離

血液樣本量為10 mL，取兩支15 mL離心管各加入5 mL分離(液與血液體積相同)用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500轉離心20分鐘(分離PBMC時離心轉速設置為慢升慢降，升為9，降調為0)離心后，此時離心管中由上至下分為4層，第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細胞層。收集血漿到新的離心管中血漿56℃30分鐘滅活900轉離心10分鐘取上清置于4℃保存，用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個和細胞層到另一個50 mL離心管中，向所得離心管中加入10 mL清洗液混勻細胞，300轉離心10分鐘，棄上清用吸管以10 mL清洗液重懸所得細胞300轉離心10分鐘，之后重復進行清洗步驟。棄上清后以0.5 mL后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。

(二)NK細胞培養(yǎng)

D0天：約用10 mL NK基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加入因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿將制備好的單個核細胞(PBMC)重懸，按細胞密度1.0-2.0M cells/mL鋪于T-75瓶中搖晃混勻后做好標記，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D4天：補加10 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿)此時瓶子含20 mL培養(yǎng)基做好標記后放,入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D6天：補加20毫升培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和5%自體血漿)此時瓶里含有40 mL培養(yǎng)基做好標記后,放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D8天：往培養(yǎng)瓶補加40 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D和1%自體血漿)同時加入因子NK-E將培養(yǎng)液轉移至T175瓶中，此時瓶子含80mL培養(yǎng)液做好標記后，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D10天：往培養(yǎng)瓶補加80 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自體血漿)此時瓶子含160 mL培養(yǎng)液做好標記后，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D12天：往培養(yǎng)瓶補加160 mL培養(yǎng)基(含因子NK-A、NK-B、NK-C、NK-D、NK-E和1%自體血漿)此時瓶子含320 mL培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液分至另一個培養(yǎng)瓶中做好標記后，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

D14天到15天:收獲目的細胞

NK細胞培養(yǎng)注意事項

采血環(huán)節(jié)注意事項

1. 因為EDTA會影響免疫細胞的激活與擴增，采集血樣時禁止使用 EDTA 抗凝的真空采樣管。

2. 采血管選擇：肝素鈉采血管>枸櫞酸鈉采血管

3. 暫存：4度

血漿

1. 自體血漿滅活前可以加入8%葡萄糖酸鈣注射液，減少血漿凝固、血漿添加后細胞出絮等問題。

2. 滅活后的自體血漿在4℃冰箱保存即可，請在一個培養(yǎng)周期內使用完畢。

3. 培養(yǎng)中后期自體血漿不足時，可以選用AB血漿

4. 不建議使用人血清白蛋白替代，其中營養(yǎng)物質較少，效果較差

血小板、紅細胞混入問題

1. 部分外周血在提取PBMC的過程中，白膜層可能會存在一些紅細胞，吸取時應盡可能避開有紅細胞部分。

2. 若不易區(qū)分，則接種PBMC應稍加大接種量。

3. 不建議加入紅細胞裂解液等，對免疫細胞的活性、增殖能力存在較大影響。

培養(yǎng)基配制及補液

1. 每次補液時添加的培養(yǎng)基需預溫，用多少取多少，禁止將整瓶培養(yǎng)基預溫、禁止反復預溫。

2. 培養(yǎng)基現配現用，配成完全培養(yǎng)基后4°保存。

1. 使用經過TC處理的細胞培養(yǎng)瓶。

2. 盡可能使用大體積的培養(yǎng)袋，促進細胞間的氣體交換，防止代謝廢物過多影響細胞增殖。

3. 如采用1L培養(yǎng)體系，推薦使用2L培養(yǎng)袋;采用2L培養(yǎng)體系，推薦每個1L體系使用1.8L培養(yǎng)袋。

4. 剛入袋時，一般細胞培養(yǎng)袋大而細胞液體積小，建議將培養(yǎng)袋對折使用(d7)，選擇合適的底面積培養(yǎng)。

5. 接種密度：外周血的推薦接種密度為1.5-2E6cells/mL;

1. 細胞接種后，第1-3天會形成懸浮細胞小團，第3-5天絕大部分懸浮細胞團貼壁，不可將其晃起，第5-7天貼壁的細胞團變大、變多，這些都是正常的細胞形態(tài)。

2. 培養(yǎng)前期一定不要吹打細胞團(D0-D5)，以減少細胞機械損傷。

NK細胞鑒定

NK細胞培養(yǎng)常見問題解答

1.問：NK細胞成團分布，如果不吹打細胞團，會引起細胞老化嗎?

1.答：NK細胞成團分布是一種非常正常的細胞形態(tài)，不吹打不會引起細胞老化。如果細胞團過大，可以在鏡下觀察，如果細胞團內部呈現一種透亮的狀態(tài)，說明團塊內部營養(yǎng)物質很充足。如果團塊呈現出漆黑的狀態(tài)，此時可以適當考慮把細胞團塊吹散。

2.問：分離單個核細胞時，紅細胞摻雜比較多，怎么改善?

2.答：分離時有時會存在紅細胞摻雜比較多的問題，紅細胞會在5～7天時皺縮凋亡，但是它會影響單個核細胞的計數。

一般有兩個處理方案：(1)對樣本下層紅色液體，按照1:2的比例采用緩沖液進行稀釋;(2)取少部分細胞懸液，做紅細胞裂解，從而達到對單個核細胞精確計數的目的。

3.問：PBMC里的NK細胞凍存復蘇后為還能繼續(xù)擴增嗎?

3.答：免疫類細胞的復蘇靜默期較長，一次凍存對于細胞質量的影響非常大。培養(yǎng)完成的NK量非常大，經過凍存后較難恢復到新鮮效果，成體NK細胞一般是直接用于臨床。

4.問：換瓶或轉袋時，舊培養(yǎng)瓶中殘留細胞如何處理?

4.答：當培養(yǎng)體積不斷擴大后，需要進行換瓶或轉袋處理。將細胞懸液轉移至新容器后，原培養(yǎng)瓶在顯微鏡下觀察通常能看到瓶壁上仍附有較多細胞和細胞團，可在原培養(yǎng)瓶中添加適當新鮮培養(yǎng)基(無需添加血漿)，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天后可觀察到大量細胞或細胞團已懸浮在培養(yǎng)液中，此時可將這些細胞懸液轉移合并回到正常體系培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋中。舊培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1-2天后仍無法脫落的細胞直接丟棄。

NK細胞的應用

預防腫瘤

1. NK細胞的活力和功效隨著年齡的增長逐漸降低

2. 隨著年齡的增長，人體免疫力逐漸減弱，腫瘤發(fā)病率逐年提高。

3. NK細胞是免疫細胞的一種，被醫(yī)學界公認為“抗癌第一道防線”

4. NK細胞可以通過釋放穿孔素、顆粒酶、抗體介導的細胞毒作用直接殺傷腫瘤細胞，而對正常的細胞沒有任何傷害。

抗衰老

1. NK免疫細胞不僅可以清除癌變、病變細胞，還具有清除衰老細胞、病毒和自由基的功效。

2. NK細胞能夠提升人體免疫力，抵抗衰老，改善睡眠，全面改善新陳代謝功能。

預防乙肝病毒

NK細胞治療可以直接清除HBV,還可以清除被病毒感染的肝細胞。通過定期回輸激活后的NK免疫細胞，進行NK細胞抗病毒，可以預防病毒性肝炎進一步惡化成肝硬化和肝癌。

保護呼吸系統(tǒng)

NK免疫細胞能顯著減輕肺部的炎性反應，清除肺部病變的細胞，為根本性預防肺部疾病帶來了希望。

預防生殖系統(tǒng)炎癥

NK免疫細胞在修復全身各器官衰老的同時，能顯著地修復生殖系統(tǒng)的衰老退化，恢復和加強男性和女性性功能。

恢復皮膚彈性，再現青春容顏

NK細胞通過清理衰老細胞、促進新陳代謝，具有顯著的美容美膚和美發(fā)效果。NK細胞能使松弛下垂的皮膚光滑收緊，恢復皮膚彈性，減少皮膚皺紋和色素沉著。

NK細胞療法臨床試驗

據統(tǒng)計，全球 NK 相關的細胞療法臨床試驗數量達 283 個。