背景簡(jiǎn)介

神經(jīng)干細(xì)胞的起源：Reynolds等于1992年首次從小鼠紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖并具有多向分化能力的細(xì)胞群，第一次提出了神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的概念。

1997年，NSCs首次被定義為一類能夠自我更新并具有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞能力的細(xì)胞。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是NSCs的主要分布場(chǎng)所，能夠作為NSCs的直接來源，而近幾年發(fā)展起來的轉(zhuǎn)分化技術(shù)使神經(jīng)干細(xì)胞的來源迅速擴(kuò)展，獲取途徑更為廣泛。

細(xì)胞形態(tài)

大鼠下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)

大鼠下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)

細(xì)胞特點(diǎn)

1. 具有自我維持和更新能力

2. 具有多向分化潛能

在不同因子下，可分化出不同類型的神經(jīng)細(xì)胞，損傷或者疾病可以刺激神經(jīng)干細(xì)胞分化。

3. 免疫源

NSCs是未分化的原始細(xì)胞，不表達(dá)成熟的細(xì)胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識(shí)別。

4. 組織融合性

可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活。

NSCs來源

胚胎源NSCs、成體腦源性NSCs、成體脊髓源性NSCs、骨髓源性NSCs、臍血源性NSCs、脂肪源性NSCs。

材料準(zhǔn)備

儀器：倒置顯微鏡，離心機(jī)，安全柜，顯微剪，尖頭鑷，微型剪，50mL離心管，10cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，40μM細(xì)胞篩，15mL離心管

試劑：NSCs神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、NSCs神經(jīng)干細(xì)胞專用消化液、PBS磷酸緩沖液。

操作步驟

提前開啟紫外線照射超鏡臺(tái)30分鐘，超鏡臺(tái)通風(fēng)10分鐘以上，水浴鍋提前開啟加熱至56℃，提前準(zhǔn)備好移液管、T75培養(yǎng)瓶、人外周血淋巴細(xì)胞分離液、清洗液、NK細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、因子、1 mL槍頭、200 μL槍頭、移液槍、15 mL離心管，提前從冰箱取出放置室溫。

大鼠下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分離培養(yǎng)

1. 將新生鼠(1-3天)放到6 厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿蓋上，噴酒精后放置超凈工作臺(tái)中。

2. 在6 厘米培養(yǎng)皿中入2-3 毫升 PBS緩沖液。

3. 將新生鼠的頭直接剪下來，放入PBS緩沖液中漂洗掉血漬。

4. 在6 厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入500-1000 微升 PBS緩沖液。

5. 取腦：用微型剪刀將腦沿中縫剪開腦皮和腦殼沿著開口起始處和終點(diǎn)處兩邊橫向各剪一刀用剪刀將嗅球連接處挑斷，把整個(gè)腦取出放入剛剛倒好的PBS緩沖液中。

6. 取下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞:將整腦翻面，腹面朝上。

下丘腦在整腦中間腹面突出部，沿著一條腦縫切三刀，邊緣修整一下后，用鑷子夾斷2/3處，取上方(即腹面)2/3的腦。

7. 在6 厘米培養(yǎng)皿中加入500 微升 NSC神經(jīng)干細(xì)胞專用消化液，將取好的下丘腦組織塊放入其中，用鑷子夾住刀片，切碎腦組識(shí)，直到?jīng)]有大的組織塊出現(xiàn)即可。.

8. 補(bǔ)1500 微升的NSC神經(jīng)干細(xì)胞專用消化液，將6 厘米培養(yǎng)皿蓋上蓋子放入培養(yǎng)箱中(37℃)消化20-30 分鐘。

9. 消化結(jié)束后加入PBS緩沖液稀釋消化液，轉(zhuǎn)移到15 毫升離心管中，最終PBS緩沖液的體積為消化液體積的3倍即可。

10. 吹打混勻后，置于離心機(jī)2000轉(zhuǎn)，離心15分鐘

11. 用泵吸掉上清，盡量吸干凈，加入NSC完全培養(yǎng)液(要分多少個(gè)孔就加多少毫升)。

12. 吹打混勻后，用40 微米 細(xì)胞篩過濾入培養(yǎng)皿中，補(bǔ)2 毫升完全培養(yǎng)液夜即可。

13. 一般一周后分細(xì)胞。

細(xì)胞傳代：懸浮細(xì)胞 (6厘米培養(yǎng)皿)

1. 將上清吸入15 毫升管中。

2. 用1毫升 PBS緩沖液潤(rùn)洗2次，加入15 毫升管中。

3. 高心，2000 轉(zhuǎn)，15 分鐘 (水平離心機(jī))。

4. 吸去上清，加入500 微升 消化液，放入培養(yǎng)箱中橫放5-10 分鐘(消化好后，會(huì)變成絮狀，輕輕吹打則變透明)。

5. 加入1500 微升 PBS緩沖液稀釋消化液，吹打幾次，至溶液變澄清。

6. 離心，轉(zhuǎn) rpm，5 分鐘。

7. 吸去上清，用新鮮NSC培養(yǎng)基重懸，分盤。

細(xì)胞凍存

消化后使用10% DMSO 的神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基凍存。

細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)觀察

神經(jīng)干細(xì)胞一般都是懸浮培養(yǎng)的，會(huì)形成神經(jīng)球.

2. 標(biāo)志物鑒定

小鼠下丘腦神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Sox2及Nestin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上。

★ SOX2+≥90%;

★ β-Tubulin + ≤10%，排除神經(jīng)元細(xì)胞;

★ GFAP + ≤10%，排除星膠細(xì)胞;

★ GalC或OSP + ≤10%，排除少突膠質(zhì)細(xì)胞

NSCs移植在腦疾病中的作用

目前，神經(jīng)干細(xì)胞移植廣泛應(yīng)用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療研究，在腦疾病的治療研究中主要包括腦損傷性疾病，各種神經(jīng)退行性疾病、遺傳代謝性疾病等。神經(jīng)干細(xì)胞療法主要包括直接的細(xì)胞替代治療，以及基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞的治療。顱腦外傷以及各種腦血管意外是腦損傷的主要原因，其共 同特點(diǎn)是局部神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的缺失，臨床表現(xiàn)為患者的運(yùn)動(dòng)、感覺以及認(rèn)知功能損害，目前尚無有效的方法促進(jìn)腦神經(jīng)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。神經(jīng)干細(xì)胞移植為改善腦損傷后遺癥帶來了希望。

NSCs移植在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病中的作用

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND)是一組病因未明的選擇性侵犯脊髓前角細(xì)胞、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、皮層錐體細(xì)胞及錐體束的慢性進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，主要包括肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)和進(jìn)行性肌肉萎縮(SMA)。該病導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，表現(xiàn)為肌萎縮及肌無力，嚴(yán)重者可致死亡，目前尚無對(duì)MND的有效治療方法。

NSCs治療MND的潛能依賴于其轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)后的生存、分化和遷移能力，最終引起緩慢的功能改善。

2021年6月，美國(guó)西達(dá)賽奈醫(yī)療中心的一項(xiàng)新的臨床試驗(yàn)獲得加利福尼亞再生醫(yī)學(xué)研究所 (CIRM)撥款1199萬美元，旨在確定使用基因工程干細(xì)胞治療ALS的可行性。

NSCs移植在帕金森疾病中的作用

帕金森病(PD)是由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的丟失造成紋狀體多巴胺遞質(zhì)分泌不足而形成的神經(jīng)退行性疾病。

神經(jīng)干細(xì)胞移植不但可以補(bǔ)充丟失的多巴胺能神經(jīng)元，而且分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以抑制多巴胺能神經(jīng)元的丟失，長(zhǎng)期有效地改善患者的癥狀。

通過基因工程將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素基因， 如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GONE)等轉(zhuǎn)入神經(jīng)干細(xì)胞，使NSCs分泌功能增加，然后把NSCs移植到腦內(nèi)，不但可以促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元釋放多巴胺遞質(zhì)，而且可以為殘留的正常多巴胺能神經(jīng)元提供更多的神經(jīng)保護(hù)。

2021年6月8日，拜耳公司(Bayer)宣布，旗下BlueRock Therapeutics公司在1期臨床試驗(yàn)中，成功地將多能干細(xì)胞生成的多巴胺能神經(jīng)元DA01首次移植給一名帕金森病患者。2021年7月19日，BlueRock公司的DA01項(xiàng)目獲得美國(guó)FDA的快速通道資格認(rèn)定。

NSCs移植在脊髓損傷中的作用

脊髓損傷使局部神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞缺失，神經(jīng)元軸突脫髓鞘，破壞了上行或下行的神經(jīng)傳導(dǎo)通路。脊髓損傷使損傷部位以F的感覺、運(yùn)動(dòng)以及自主調(diào)節(jié)功能受損。由于NSCs具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，利用神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷部位進(jìn)行細(xì)胞替代和轉(zhuǎn)基因治療是目前脊髓損傷治療研究的熱點(diǎn)。