背景簡介

大鼠成骨細(xì)胞分離自顱骨組織，成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。骨不斷地進(jìn)行著重建，骨重建過程包括破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩；其后，成骨細(xì)胞移行至被吸收部位，分泌骨基質(zhì)，骨基質(zhì)礦化而形成新骨；破骨與成骨過程的平衡是維持正常骨量的關(guān)鍵。成骨細(xì)胞培養(yǎng)不僅有助于了解骨形成機(jī)制、骨骼系統(tǒng)疾病的分子和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，也是藥物篩選、生物材料開發(fā)和生物工程研究的重要手段。

細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞特點(diǎn)

1. 形態(tài)

成骨細(xì)胞通常呈扁平的多角形狀。它們的細(xì)胞體積較大胞質(zhì)豐富，有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。成骨細(xì)胞的胞質(zhì)中含有大量的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這些細(xì)胞器對于合成和分泌骨基質(zhì)起到重要的作成骨細(xì)胞在骨形成過程中起到了關(guān)鍵的作用。當(dāng)骨基質(zhì)用。

2. 細(xì)胞分布

成骨細(xì)胞主要分布在骨組織的骨膜和骨骼表面。它們通常與其他細(xì)胞形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，如成骨細(xì)胞與骨母細(xì)胞和骨基質(zhì)形成的骨小梁。成骨細(xì)胞與骨吸收細(xì)胞(如破骨細(xì)胞)密切相關(guān)，通過相互作用維持骨骼的平衡。

3. 分泌功能

成骨細(xì)胞具有高度的分泌功能，能夠產(chǎn)生和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)分子，如膠原蛋白、骨基質(zhì)糖蛋白和骨鈣素等。這些分泌物是構(gòu)成骨基質(zhì)的重要組成部分，對于維持骨骼的結(jié)構(gòu)和功能起著重要的作用。

4. 鈣沉積

成骨細(xì)胞在骨形成過程中起到了關(guān)鍵的作用。當(dāng)骨基質(zhì)被合成和分泌后，成骨細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的鈣通道將鈣離子從細(xì)胞外輸送到細(xì)胞內(nèi)，并將其沉積在骨基質(zhì)中，使骨組織逐漸形成。這個(gè)過程被稱為鈣沉積，是骨形成的重要步驟。

5.骨吸收調(diào)節(jié)

除了參與骨形成過程外，成骨細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)骨吸收的功能。它們能夠感知和響應(yīng)骨骼的力學(xué)刺激和生化刺激，通過調(diào)節(jié)骨吸收細(xì)胞的活性和數(shù)量，維持骨骼的平衡。當(dāng)骨骼受到外界刺激時(shí)，成骨細(xì)胞能夠釋放一些因子，抑制骨吸收細(xì)胞的活性，減少骨骼的破壞。

材料準(zhǔn)備

儀器

離心機(jī)、顯微鏡、計(jì)數(shù)器、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱。

試劑

成骨細(xì)胞專用消化液Ⅰ、成骨細(xì)胞專用消化液Ⅱ、PBS磷酸緩沖液、成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基

耗材

TC處理的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、T75培養(yǎng)瓶、槍頭、離心管、細(xì)胞篩、移液管

操作步驟

1.取2-3天新生鼠，并用70%乙醇消毒。將新生放入一個(gè)大培養(yǎng)皿中。

2.用大剪刀取下頭部，抓住頸背處的頭部，沿著顱底做一個(gè)小切口。使用鑷子和鑷子小心地從頭骨上去除皮膚和腦組織。

3.切掉下頜，刮掉顱骨邊緣周圍的任何多余的組織和軟骨。

4.將顱骨切成兩半，放入平底5毫升管中； 用PBS清洗。

5.將頭蓋骨在成骨細(xì)胞專用消化液Ⅰ中消化，37°C孵育10分鐘。取出并吸棄胰蛋白酶溶液; 成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基中洗滌(血清和鈣將使任何殘留的胰蛋白酶失活)。

6.在成骨細(xì)胞專用消化液Ⅰ中消化，37°C孵育30分鐘。

7.取出成骨細(xì)胞專用消化液Ⅱ，吸棄，換成新鮮的溶液在37°C下再溶液60分鐘。

8.保留最終消化物并轉(zhuǎn)移到15ml離心管中。用成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基洗滌顱骨，將溶液轉(zhuǎn)移到含有最終消化物的15ml管中

9.在室溫下以1500×g離心細(xì)胞溶液5分鐘。棄去上清液并將細(xì)胞沉淀重懸于成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基中。合并細(xì)胞懸液。

10.將20 mL 成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基加入2×75cm2培養(yǎng)瓶中;向每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入1ml細(xì)胞懸液。

11.將培養(yǎng)瓶在 37°C/ 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到匯合。

染色鑒定圖(大鼠成骨細(xì)胞示例)

茜素紅染色

ALP染色

骨的形態(tài)

骨是人體重要的器官，起著支撐移動(dòng)保護(hù)等作用。根據(jù)形狀，可將骨分為四類：長骨，短骨，扁骨，不規(guī)則骨。以長骨為例，長骨分為兩個(gè)主要區(qū)域：骨干和骨骺，骨骺與骨干連接處稱為干骺端。

骨細(xì)胞的分類

骨細(xì)胞分為四類，成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，祖細(xì)胞，破骨細(xì)胞。其中破骨細(xì)胞來源各種干細(xì)胞，干細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞進(jìn)一步分化為破骨細(xì)胞。而祖細(xì)胞分化為前成骨細(xì)胞，再分化為成熟的成骨細(xì)胞，最后分化為骨細(xì)胞。那么幾種細(xì)胞間如何發(fā)生相互影響作用呢?

成熟的骨又是怎么生成的呢?骨的發(fā)生有倆種方式。分別為膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨。

膜內(nèi)化骨

膜內(nèi)化骨主要發(fā)生于部分頂骨、顱底、面骨、鎖骨等，其過程是間充質(zhì)細(xì)胞直接分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞產(chǎn)生骨基質(zhì)并被包埋于基質(zhì)中逐漸轉(zhuǎn)化為骨細(xì)胞。

1. 間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，骨化中心形成。

2. 分泌類骨質(zhì)包裹成骨細(xì)胞，分化為骨細(xì)胞。

3. 小梁基質(zhì)和骨膜形式。

4. 致密骨向小梁骨淺表發(fā)展，擁擠的血管凝結(jié)成紅色骨髓。

軟骨內(nèi)化骨

骨骼是通過替換透明軟骨發(fā)育而來。軟骨作為模板被新骨完全取代。軟骨內(nèi)骨化比膜內(nèi)骨化需要更長的時(shí)間。顱底的骨骼和長骨通過軟骨內(nèi)骨化形成。

1. 原發(fā)骨化中心，骨領(lǐng)出現(xiàn)。

2. 血管長入，成骨細(xì)胞逐漸替代軟骨細(xì)胞。

3.繼發(fā)骨化點(diǎn)出現(xiàn)，同時(shí)髓腔擴(kuò)大。

4.骨骺線出現(xiàn)，形成骨骼。

骨折分類

當(dāng)發(fā)生骨折時(shí)，無論有無及時(shí)的緊急救治，最終都會(huì)發(fā)生愈合。骨折有多種分類。根據(jù)有無暴露于組織外分為開放性骨折和閉合性骨折。

骨折修復(fù)

1. 破裂的血管滲出血液，凝結(jié)成骨折血腫。

2. 軟骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞形成內(nèi)部和外部愈合組織。

3. 軟骨內(nèi)骨化逐漸被小梁骨取代。

4. 重塑用成熟骨代替未成熟的骨。