今天推薦的是由澳大利亞維多利亞州帕克維爾墨爾本大學(xué)醫(yī)學(xué)生物學(xué)系在2018年5月15日發(fā)表的一篇文章，通訊作者是Eicke Latz教授，研究主要闡述了小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的永生化。

研究背景

巨噬細(xì)胞是一種特化的吞噬細(xì)胞，對宿主免疫系統(tǒng)具有多種重要功能。它們對識別外源性和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號尤為重要，是先天性免疫反應(yīng)的防御前線。因此，小鼠巨噬細(xì)胞常用于基于體外細(xì)胞的試驗(yàn)，以研究先天性免疫激活的機(jī)制，這需要不斷培育和飼養(yǎng)大量轉(zhuǎn)基因小鼠品系。

摘要部分

在這里，研究人員介紹了一種從原代小鼠骨髓細(xì)胞中生成永生化骨髓源性巨噬細(xì)胞(iBMDMs)的穩(wěn)健方案。研究人員還提供了收獲、冷凍和解凍骨髓細(xì)胞、維持iBMDMs培養(yǎng)以及通過單細(xì)胞克隆生成單克隆iBMDMs群體的一般方案。

研究內(nèi)容

1. 巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多種關(guān)鍵作用

這些功能包括吞噬微生物、宿主衍生物質(zhì)、細(xì)胞碎片和凋亡細(xì)胞以進(jìn)行消化;通過模式識別受體(PRR)識別危險(xiǎn)信號;向適應(yīng)性免疫細(xì)胞展示抗原;最重要的可能是產(chǎn)生對宿主免疫反應(yīng)和修復(fù)局部組織損傷至關(guān)重要的炎癥介質(zhì)(圖1)。巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞表達(dá)的PRRs家族識別危險(xiǎn)信號，如微生物成分或修飾過的宿主分子，構(gòu)成了先天性免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)。PRRs通常根據(jù)其在細(xì)胞質(zhì)膜和溶酶體內(nèi)膜或細(xì)胞膜內(nèi)的定位進(jìn)行分類。Toll樣受體(TLRs)和C型凝集素受體(CLRs)存在于細(xì)胞膜上，而視黃酸誘導(dǎo)基因I(RIG-I)樣受體(RLRs)、核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域(NOD)樣受體(NLRs)和幾種細(xì)胞膜DNA受體(CDRs)則表達(dá)于細(xì)胞膜上(圖1)。大多數(shù)PRRs的激活會導(dǎo)致細(xì)胞因子(如TNF、IL-6)、趨化因子和I型干擾素(IFNs)的轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生。一些PRRs形成大型寡聚信號平臺，稱為炎性體。炎性體的激活不是引發(fā)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，而是導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-1家族成員(如IL-1和IL-18)被caspase-1蛋白質(zhì)分解和成熟，并啟動炎癥形式的程序性細(xì)胞死亡，即所謂的"熱噬"。形成炎癥體的PRRs包括一些NLRs(如NLRP1、NLRP3、NLRC4)以及PYRIN和黑色素瘤缺失2(AIM2)。先天性免疫途徑下游炎癥介質(zhì)的最終分泌動員了宿主免疫細(xì)胞大軍的招募，并促進(jìn)了急性炎癥反應(yīng)。

先天性免疫系統(tǒng)十分復(fù)雜，涉及大量蛋白質(zhì)。因此，對先天性免疫激活機(jī)制的研究往往在很大程度上依賴于獲得各種轉(zhuǎn)基因小鼠。體外研究通常使用這些小鼠品系產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞。由于動物飼養(yǎng)和繁殖的持續(xù)成本和空間要求很高，這種對眾多小鼠品系的依賴會嚴(yán)重影響研究人員在該領(lǐng)域的工作。另一種替代方法是使用Cre-J2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法對特定小鼠品系的巨噬細(xì)胞群進(jìn)行永生化。永生化的小鼠巨噬細(xì)胞在表型上與原代巨噬細(xì)胞相似，具有巨噬細(xì)胞的許多標(biāo)志性功能。Cre-J2逆轉(zhuǎn)錄病毒感染永生化方法已被證明可有效作用于多種小鼠巨噬細(xì)胞群，包括骨髓衍生巨噬細(xì)胞、胎肝巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。這種永生化方法的基礎(chǔ)是用J2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞，該病毒來源于復(fù)制缺陷的3611-Moloney肉瘤病毒(MSV)，攜帶v-raf和v-myc癌基因。由于沒有編碼必要的病毒包裝蛋白(gag-pol、env)，J2病毒本身存在復(fù)制缺陷。因此，研究人員使用病毒包裝輔助細(xì)胞系Psi-Cre-J2(以NIH3T3成纖維細(xì)胞為背景)來生產(chǎn)重組Cre-J2逆轉(zhuǎn)錄病毒。該細(xì)胞系表達(dá)兩個(gè)突變的莫隆尼鼠白血病病毒衍生的前病毒基因組，在gag-pol或env區(qū)域攜帶互補(bǔ)突變。每個(gè)基因組都刪除了Psi序列，從而防止在復(fù)制過程中將逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組大量包裝到病毒外殼中。因此，這種設(shè)計(jì)能夠生產(chǎn)Cre-J2逆轉(zhuǎn)錄病毒，而不會產(chǎn)生輔助病毒，這是一個(gè)重要的安全特性。研究人員和其他許多人已經(jīng)有效地利用Cre-J2方法使大量轉(zhuǎn)基因小鼠的巨噬細(xì)胞永生，這有助于研究與先天性免疫領(lǐng)域相關(guān)的許多機(jī)制，例如檢查細(xì)胞因子和IFN的轉(zhuǎn)錄控制，以及研究炎性體和TLR生物學(xué)。這些細(xì)胞還非常適合通過逆轉(zhuǎn)錄或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)引入修飾蛋白來生成報(bào)告細(xì)胞系。

圖1. 巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著多種關(guān)鍵作用

研究結(jié)論：巨噬細(xì)胞是一種吞噬性白細(xì)胞，遍布于人體的大多數(shù)組織中，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對宿主的生理和病理炎癥反應(yīng)具有重要功能。

2. Cre-J2永生化病毒的生產(chǎn)和收獲，用于生成單克隆iBMDM群體的單細(xì)胞克隆

在本章中，研究人員介紹了小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs)永生化的綜合方法。這包括具體的方案，如Cre-J2永生化病毒的生產(chǎn)和收獲(見圖2)、骨髓(BM)細(xì)胞到BMDMs的收獲和分化、用Cre-J2感染BM細(xì)胞，以及選擇iBMDMs的長期培養(yǎng)方法(見圖3)。此外，研究人員還提供了一些有助于開展這項(xiàng)工作的通用方法，包括冷凍和解凍原代BM細(xì)胞、iBMDMs的一般培養(yǎng)以及用于生成單克隆iBMDM群體的單細(xì)胞克隆(見圖3)，這些方法可用于下游應(yīng)用，如篩選方法。

以下方案需要生成 Cre-J2 逆轉(zhuǎn)錄病毒。盡管 Cre-J2 是一種生態(tài)型(小鼠特異性)逆轉(zhuǎn)錄病毒，但在生產(chǎn)和處理過程中仍需謹(jǐn)慎。在使用生物危險(xiǎn)材料和生成轉(zhuǎn)基因生物時(shí)，請始終遵循您所在機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)原則，并確認(rèn)所需的生物安全級別(或當(dāng)?shù)赝燃墑e)，同時(shí)始終穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)設(shè)備 (PPE)。

圖2. 小鼠巨噬細(xì)胞的永生化

圖3. 通過單細(xì)胞克隆生成單克隆iBMDM細(xì)胞

研究結(jié)論：介紹了小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDMs)永生化的綜合方法。

材料方法

1）生產(chǎn)含 Cre-J2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液

1. 在 37 °C、5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中，用 T150 cm2 的 TC 燒瓶，在完全 DMEM 中培養(yǎng) Cre-J2 病毒生產(chǎn)細(xì)胞，直到細(xì)胞達(dá)到 ~100% 的融合度。

2. 吸出細(xì)胞中的全 DMEM，用 10 mL 無菌 PBS 輕輕清洗，收獲 Cre-J2 病毒產(chǎn)生的細(xì)胞。

3. 在加入 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 之前吸干 PBS，然后在 37 °C 下孵育細(xì)胞 5 分鐘。

4. 4. 經(jīng)胰蛋白酶-EDTA 處理后，用 15 mL 完全 DMEM 將 Cre-J2 病毒產(chǎn)生的細(xì)胞收集到 50 mL 試管中，最終細(xì)胞體積為 20 mL。

5. 5. 在新的 T150 cm2 TC 燒瓶中加入 15 mL(75%)收獲的 Cre-J2 病毒產(chǎn)生細(xì)胞和 5 mL 新鮮的全 DMEM，最后得到 20 mL 細(xì)胞體積。

6. 將裝有 Cre-J2 病毒產(chǎn)生細(xì)胞的 T150 cm2 TC 燒瓶置于 37 °C、5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 24 小時(shí)后，可收獲含有 Cre-J2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液。

8. 用 25 mL 血清學(xué)移液管從 Cre-J2 細(xì)胞中收集細(xì)胞上清，并加入 50 mL 無菌試管中。

9. 取一個(gè) 50 毫升魯爾鎖無菌注射器，取下活塞，將其放在一邊。

10. 將 0.45 μm 過濾器連接到注射器管端。

11. 將裝有 0.45 μm 過濾器的注射器放在新的 50 mL 無菌試管上。

12. 非常小心地將 Cre-J2 細(xì)胞的上清液傾入針筒，然后重新插入活塞。

13. 通過 0.45 μm 過濾器將病毒過濾到 50 mL 錐形管中。

14. 以一次性使用的形式分取病毒，并冷凍在 80 °C。

2） 收獲小鼠骨髓細(xì)胞

1. 開始之前，將手術(shù)鑷子和剪刀放入裝有約 35 毫升 70-80% 乙醇的 50 毫升試管中，并為每只小鼠準(zhǔn)備一個(gè)裝有 5 毫升 PBS 的 10 平方厘米培養(yǎng)皿。

2. 按照動物倫理指導(dǎo)原則對小鼠實(shí)施安樂死。

3. 用 70-80% 乙醇浸濕小鼠皮毛。

4. 用鑷子夾起腹膜上方的皮膚，然后用剪刀做一個(gè)小切口。

5. 5. 從切口處開始剝離后腿上的皮膚，并向下剝至腳部。

6. 用剪刀在髖關(guān)節(jié)上方切除后腿，保留股骨。

7. 用剪刀從踝關(guān)節(jié)下方切除腳，保持脛骨完整。

8. 將股骨和脛骨放入之前準(zhǔn)備好的裝有 PBS 的 10 平方厘米培養(yǎng)皿中。

9. 在無菌條件下，在層流凈化罩中繼續(xù)進(jìn)行操作。

10. 用剪刀和鑷子盡可能多地去除骨骼周圍的組織，使骨骼保持完整。

11. 每次用紙巾夾住一根骨頭，用拇指和食指輕輕滾動，去除殘留組織。這樣做之后，骨頭上應(yīng)該就幾乎沒有組織了。

12. 在 10 平方厘米培養(yǎng)皿的蓋子上注入 70-80% 的乙醇。

13. 將骨頭放入 70-80% 的乙醇中約 30 秒，然后將骨頭放回 PBS 中。

14. 用剪刀從四根骨頭的兩端各剪下少量。

15. 在連接 10 毫升注射器的 25-G 注射針中注入無血清 DMEM，然后將針頭插入骨的骨髓腔。

16. 用無血清 DMEM 沖洗每個(gè)骨腔，將其裝入 50 mL 試管中，直到骨頭大部分呈白色。從另一端再次沖洗骨髓腔可獲得更多細(xì)胞。

17. 重復(fù)上述步驟 15，將一只小鼠的所有骨骼放入同一 50 mL 試管中。

18. 在 RT 下以 ~500 × g 離心細(xì)胞 5 分鐘，然后吸出培養(yǎng)基。

19. 此時(shí)可將 BM 細(xì)胞冷凍，以便日后使用或運(yùn)輸。

20. 20. 用 1-2 mL RBC 裂解緩沖液重懸細(xì)胞團(tuán)，并在 RT 條件下培養(yǎng) 10 分鐘。

21. 用無菌 PBS 使試管中的容量達(dá)到 50 mL。

22. 在 RT 條件下以 ~500 × g 離心細(xì)胞 5 分鐘，吸出細(xì)胞團(tuán)中的液體。

23. 用 10 mL 完全 DMEM 重懸 BM 細(xì)胞。

24. 將一只小鼠的 BM 細(xì)胞培養(yǎng)到 4× 無菌 T75 cm2 TC 燒瓶中，加入 15 mL 補(bǔ)充有 20% L929 條件培養(yǎng)基的全 DMEM?；蛘?，也可以解凍冷凍的 BM 細(xì)胞，然后進(jìn)行培養(yǎng)。

25. 將燒瓶置于 37 °C、5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中。

3）冷凍原始小鼠骨髓細(xì)胞

1. 在造粒 BM 細(xì)胞之前，配制新鮮的細(xì)胞凍存液并標(biāo)記無菌冷凍瓶。

2. 將 1 只小鼠(即 2× 脛骨和 2× 股骨)的 BM 重懸于 1 mL 冷凍液中。

3. 在無菌冷凍瓶中加入 1 毫升冷凍溶液中重新懸浮的 BM 細(xì)胞。

4. 將冷凍瓶加入可控速率的冷凍儀器中，在 80 °C的溫度下培養(yǎng)至少 24 小時(shí)。

5.將含有冷凍的 BM 細(xì)胞的冷凍瓶移至液氮容器中長期保存。

4. 解凍原代小鼠骨髓細(xì)胞。

1. 從液氮儲存器中收集含有冷凍 BM 細(xì)胞的冷凍瓶，放在干冰上保存。

2. 在無菌條件下的層流凈化罩中，向 50 mL 試管中加入 9 mL 預(yù)熱的全 DMEM。

3. 3. 將凍存管置于 37 °C 水浴中，快速解凍 BM 細(xì)胞，直至只剩下少量冰塊。

5. 用 CreJ2 病毒感染巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞。

1. 培養(yǎng) BM 細(xì)胞 3 天后，巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞就可以感染 CreJ2 病毒了。確保有另外一管第 3 天的細(xì)胞作為無 CreJ2 病毒的陰性對照。

2. 取所需數(shù)量的含有 Cre-J2 病毒上清液的冷凍等分試管，將試管放在 37 °C 水浴中解凍，直到?jīng)]有冰塊為止。

3. 吸出燒瓶中的培養(yǎng)基。

4. 在含有粘附的巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞的燒瓶中加入 3 mL 完全 DMEM、2 mL L929 條件培養(yǎng)基(20%)和 5 mL 解凍的含 Cre-J2 病毒的上清液(50%)。

5. 對無 Cre-J2 病毒陰性對照燒瓶執(zhí)行步驟 3-4，用完全 DMEM 代替 5 mL 解凍的含 Cre-J2 病毒上清液。

6. 將燒瓶放入 37 °C、5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中。

7. 感染 24 小時(shí)后，從含有 Cre-J2 病毒細(xì)胞的燒瓶和對照燒瓶中吸取培養(yǎng)基，并用 20% L929 條件培養(yǎng)基取代 15 mL 完全 DMEM。

8. 將燒瓶放入 37 °C、5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中。

9. 24 小時(shí)后，重復(fù)步驟 3-7 進(jìn)行第二輪 Cre-J2 感染。

10. 將平板放入 37 °C、5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6. 用于篩選骨髓來源巨噬細(xì)胞的長期培養(yǎng)方法。

1. 第二輪 Cre-J2 感染約 7 天后，吸出細(xì)胞上的培養(yǎng)基。

2. 加入新鮮的完全 DMEM，將 L929 條件培養(yǎng)基的濃度降至 10%。

3. 在接下來的 2 周內(nèi)逐漸降低 L929 的濃度。

4. 在這 2 周內(nèi)，任何未感染的 BMDMs 都將死亡，來自無 Cre-J2 病毒陰性對照燒瓶的 BMDMs 也將死亡。

5. 繼續(xù)逐漸降低 L929 條件培養(yǎng)基的濃度，直到 BMDMs 能夠在沒有任何 L929 條件培養(yǎng)基的情況下存活和增殖。這一斷奶過程通常需要 2 到 6 個(gè)月才能獲得完全永生化的 BMDMs(iBMDMs)。

6. 現(xiàn)在可以直接將 iBMDMs 與原代 BMDMs 進(jìn)行表型評估，包括通過流式細(xì)胞術(shù)(如 F4/80、Mac-1、MHC-II)和功能測試(吞噬/細(xì)菌攝取、對免疫刺激的反應(yīng))檢查巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。

7. 骨髓來源巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)。

1. 當(dāng) iBMDM 融合時(shí)，從 T75 cm2 TC 燒瓶中吸走培養(yǎng)基。

2. 用 10 mL 無菌 PBS 沖洗粘附的細(xì)胞單層，然后再吸出。

3. 向粘附的細(xì)胞單層加入 3 mL 胰蛋白酶-EDTA，并在 37 °C 下孵育 5 分鐘。

4. 37 °C 孵育 5 分鐘后，用一只手的手掌用力拍打燒瓶，去除粘附的 iBMDM。

5. 用 7 mL 完全 DMEM 收獲 iBMDM。

6. 將一定比例的 iBMDMs 加入一個(gè)新的 T75 cm2 TC 燒瓶中，燒瓶中裝有

15 mL 新鮮的完全 DMEM。

7. 每 2-3 天傳代一次 iBMDMs。

8. 單細(xì)胞克隆骨髓衍生巨噬細(xì)胞。

1. 按小標(biāo)題 3.7 步驟 1-5 收獲細(xì)胞。

2. 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對細(xì)胞/特里潘藍(lán)試劑(用于染色死細(xì)胞)進(jìn)行 1:10 稀釋，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

3. 將 iBMDMs 的濃度調(diào)整為每毫升 1 × 106 個(gè)細(xì)胞。

4. 取 50 μL iBMDMs(每毫升 1 × 106 個(gè)細(xì)胞)，將其加入 50 mL 完全 DMEM(相當(dāng)于每毫升 1000 個(gè)細(xì)胞)，以 1:1000 的比例稀釋細(xì)胞。

5. 取 500 μL 1:1000 稀釋液，將細(xì)胞進(jìn)一步稀釋至 1:100，并加入 50 mL 完全 DMEM 中，相當(dāng)于每毫升 10 個(gè)細(xì)胞(或每 100 μL 1 個(gè)細(xì)胞)。

6. 按每毫升 10 個(gè)細(xì)胞的比例將 50 毫升細(xì)胞加入 10 平方厘米的無菌培養(yǎng)皿或無菌移液管中。

7. 使用 P200 多通道移液器，以每孔 100 μL(相當(dāng)于每孔 ~1 個(gè)細(xì)胞)的量裝入 5 × 96 孔板。

8.在 37 °C 下培養(yǎng)平板。

9. 7-10 天后，使用明視野顯微鏡檢查各孔中的單克隆細(xì)胞生長情況。

10. 選擇一些克隆細(xì)胞并將這些細(xì)胞擴(kuò)增(例如，從 96 孔擴(kuò)增到 48 孔，再從 48 孔擴(kuò)增到 24 孔)，直到有合適的細(xì)胞數(shù)量用于進(jìn)行功能測試。根據(jù) iBMDM 的用途，測試克隆最合適的功能，如生長速度和對特定配體的反應(yīng)。