背景簡介

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)，是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣泛的一類細(xì)胞，也是膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種。用經(jīng)典的金屬浸鍍技術(shù)(銀染色)顯示此類膠質(zhì)細(xì)胞呈星形，從胞體發(fā)出許多長而分支的突起，伸展充填在神經(jīng)細(xì)胞的胞體及其突起之間，起支持和分隔神經(jīng)細(xì)胞的作用。

細(xì)胞形態(tài)

小鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、多角形，細(xì)胞可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)最佳。

小鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)

小鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)

細(xì)胞特點(diǎn)

1. 機(jī)械支持和營養(yǎng)作用

填充神經(jīng)元和血管之外的空間，并能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，有利于神經(jīng)元的生長、發(fā)育、存活和發(fā)揮功能。

2. 隔離、絕緣和屏障作用

防止鄰近的神經(jīng)元相互干擾，且參與形成血—腦屏障，對物質(zhì)的運(yùn)輸有一定選擇作用。

3. 修復(fù)和增生作用

用以填充因缺氧、外傷或疾病等發(fā)生變性并清除后留下的組織缺損，不過值得一提的是，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生過強(qiáng)，往往可形成腦瘤，成為引起癲癇發(fā)作的病灶。

4. 免疫應(yīng)答作用

即星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜上表達(dá)的MHC II(一種與免疫相關(guān)的復(fù)合分子)可與經(jīng)過處理后的外來抗原結(jié)合，將其呈遞給T淋巴細(xì)胞。

5. 遷移引導(dǎo)作用

引導(dǎo)發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞遷移到定居部位。

6. 穩(wěn)定CNS中K+和H+濃度

通過吸收K+和H+來阻止細(xì)胞外液中這兩種離子的濃度增加，并可通過細(xì)胞間的縫隙連接將其分散到周圍其它的星形膠質(zhì)細(xì)胞，

材料準(zhǔn)備

1. 工具

小鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基Astrocyte basal Medium (ABM)、HBSS緩沖液緩沖液、PBS磷酸緩沖液、75%酒精、多聚賴氨酸、尖頭鑷、彎鑷、剪刀、冰盤、10 cm培養(yǎng)皿、6 cm 培養(yǎng)皿。

2. 提前開啟紫外線照射超凈臺30min

將培養(yǎng)基和添加劑室溫融化，使用前室溫中預(yù)溫10-30 min。HBSS緩沖液緩沖液預(yù)冷，紫外照射完畢后，75%酒精消毒超凈臺，超凈臺通風(fēng)10 min以上。

3.包被培養(yǎng)皿

將10x的多聚賴氨酸稀釋成1x的工作液，將培養(yǎng)瓶底部加滿。過夜或兩小時，結(jié)束后，使用PBS緩沖液洗2-3次備用。

小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)操作步驟

1. 取3個10 cm 培養(yǎng)皿，3個6 cm 培養(yǎng)皿倒入HBSS緩沖液,置于冰盤上。

2. 取出生2天內(nèi)的新生鼠，泡入裝有75%酒精的離心管內(nèi)。

3. 待小鼠死亡后，在1中漂洗2-3次。

4. 取腦子：用尖頭鑷剝離鼠頭部及腦殼，取出腦子，放入6 cm培養(yǎng)皿。

5. 剝腦膜：將一個腦移至一個新的6 cm 培養(yǎng)皿(兩三個腦子用一個6 cm培養(yǎng)皿，防止太久HBSS緩沖液升溫)，在解剖鏡下去除嗅球，小腦及兩個大腦半球中間的連接物，將剝干凈的皮層放入新的6 cm培養(yǎng)皿。

6. 將剝離好的皮層夾碎至漿糊狀，組織使用神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基稀釋，準(zhǔn)備鋪入包被的培養(yǎng)瓶。

T75培養(yǎng)瓶3個腦袋，大培養(yǎng)瓶 4-5個腦袋。

7. 每3-5天換液，一般12天左右長滿，長滿后開始傳代。

細(xì)胞標(biāo)志物鑒定

小鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上。

小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes)純化

1.差速貼壁法純化星形膠質(zhì)細(xì)胞

P0細(xì)胞消化后，鋪皿1h貼壁后下層細(xì)胞中GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞所占比例較大，未貼壁的懸浮細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

2.搖培

原代細(xì)胞培養(yǎng)至第 3d， 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于無菌 37 ℃ 恒溫?fù)u床上， 260 r/min 震蕩處理 2 h，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕吹打瓶底， 盡量去除震蕩后貼壁不牢的其他雜細(xì)胞， 然后將瓶內(nèi)培養(yǎng)液1 000 r/min 離心 5 min， 上清液重新轉(zhuǎn)移至原細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)， 同時補(bǔ)入 2. 0 ～ 3. 0 mL 新鮮培養(yǎng)液。

研究應(yīng)用

揭開分子和機(jī)制的面紗

對星形膠質(zhì)細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行全面的分析，有助于揭示復(fù)雜現(xiàn)象，并為探索實(shí)驗(yàn)提供初步指導(dǎo)。目前已有幾種星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯譜的相關(guān)研究，包括使用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分子圖譜進(jìn)行早期評估、體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞分子圖譜的選擇性基因靶向研究、以及單細(xì)胞水平星形膠質(zhì)細(xì)胞的分子特征。

基因靶向

總結(jié)了用于星形膠質(zhì)細(xì)胞研究的主要小鼠品系及特性，包括表達(dá)Cre重組酶的品系以及病毒載體。目前，最可靠的小鼠品系是Aldh1l1-Cre/ERT2，最可靠的病毒是將AAV2/5與GfaABC1D啟動子結(jié)合使用。

探索形態(tài)學(xué)

可靠地觀測和跟蹤星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化至關(guān)重要?？偨Y(jié)了星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同尺度下的形態(tài)學(xué)研究方法。

目前的主要挑戰(zhàn)是開發(fā)實(shí)時成像方法，這依賴于組織固定方法、自動化示蹤技術(shù)以及機(jī)器學(xué)習(xí)等。仍有許多問題待解決。

探索鈣信號

與目前已經(jīng)開發(fā)出多種針對Ca2+、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的基因編碼傳感器，未來更多傳感器的開發(fā)將使研究人員能夠直接監(jiān)測星形膠質(zhì)細(xì)胞Ca2+的下游效應(yīng)。

治療的干預(yù)途徑

針對神經(jīng)退行性變中的星形膠質(zhì)細(xì)胞的多種治療策略已經(jīng)被提出。這些策略包括基于星形膠質(zhì)細(xì)胞富集靶點(diǎn)建立的藥理學(xué)方法、使用藥物或基因手段靶向星形膠質(zhì)細(xì)胞中的通路、靶向轉(zhuǎn)錄因子修改星形膠質(zhì)細(xì)胞中特定基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)、將健康的星形膠質(zhì)細(xì)胞移植到受神經(jīng)退行性變影響的區(qū)域或?qū)⑿切文z質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元以取代受損細(xì)胞。