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今天推薦的是由美國阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學院在2021年發(fā)表于Frontiers in Cellular Neuroscience (2021 IF 6.147, JCR/Q1)的一篇文章，通訊作者是Mia M. Thi 教授and Marcia Urban-Maldonado教授。

文章摘要

我們用編碼 hTERT 的慢病毒載體轉導了從四窩胚胎野生型 (WT) 和 無connexin 43 (Cx43) 小鼠幼崽培養(yǎng)的小鼠皮質星形膠質細胞，并測量了星形膠質細胞特異性標志物的表達直至第 10 代 (p10)。由此產生的永生化細胞系(分別稱為 IWCA 和 IKOCA)表達的生物標志物與新生小鼠星形膠質細胞的生物標志物一致，包括來自野生型但不來自 Cx43 缺失小鼠的 Cx43、缺乏 Cx30 和存在 Cx26。 AQP4 是在星形膠質細胞端足中發(fā)現(xiàn)的高豐度水通道，在早期傳代中表達水平適中，其 mRNA 和蛋白質下降至低水平，但 p10 仍可檢測到。星形膠質細胞生物標志物醛脫氫酶 1L1 (ALDH1L1)、谷氨酰胺合成酶 (GS) 和膠質纖維酸性蛋白 (GFAP) 的 mRNA 水平在連續(xù)傳代期間保持相對恒定。 GS 蛋白表達得以維持，而 GFAP 隨著細胞傳代而下降，但在 p10 時仍可檢測到。谷氨酸轉運蛋白 1 (GLT-1) 的 mRNA 和蛋白質水平均隨傳代次數(shù)而下降。相應時間的免疫染色與蛋白質印跡的數(shù)據一致，并提供了這些蛋白質在適當?shù)募毎麅任恢帽磉_的證據。與我們生成 Cx43 功能性表達或缺失的永生化細胞系的目標一致，發(fā)現(xiàn) IWCA 細胞在細胞間染料轉移方面耦合良好，并且在連接形成的時間過程、電耦合方面與原代星形膠質細胞培養(yǎng)相似強度和電壓靈敏度。此外，在 IWCA 細胞系與 bEnd.3 微血管內皮細胞的共培養(yǎng)中，屏障功能得到了增強。此外，免疫染色顯示 IWCA 中的扁平內源性 Cx43 間隙連接斑塊在外觀上與用熒光蛋白標記的 Cx43 轉染 IKOCA 細胞后獲得的斑塊相似。 IKOCA 細胞中 Cx43 的重新表達允許對連接蛋白進行實驗操作和實時成像之間的相互作用 連接蛋白和其他蛋白質。我們得出結論，這些細胞系的特性類似于原代培養(yǎng)的星形膠質細胞，它們可以通過在適合星形膠質細胞的細胞環(huán)境中促進遺傳和藥理學操作，為功能研究提供有用的工具。

研究背景

脊椎動物間隙連接 (GJ) 由連接蛋白家族形成。 GJ 通道在相鄰細胞之間提供載流離子、代謝底物和信號分子的直接胞質交換。最廣泛和最豐富的 GJ 蛋白是連接蛋白 43 (Cx43)，它是大腦中心肌細胞、脈管系統(tǒng)和星形膠質細胞之間的主要 GJ 蛋白。通過 Cx43 GJs 進行的細胞間通訊在其表達的組織中介導關鍵的基本功能，包括整個心臟的收縮傳播、神經前體細胞遷移過程中的信號傳導以及通訊隔間中細胞功能的協(xié)調。因為它是一種豐富的 GJ 蛋白，所以當?shù)谝恢?Cx43-null 小鼠產生時，純合的無效幼崽在出生后不久就死亡也就不足為奇了(Reaume 等，1995)。令人驚訝的是，圍產期死亡率不是整個心臟節(jié)律傳播紊亂的結果，而是由于延遲的神經嵴細胞遷移和隨后的左心室流出道發(fā)育缺陷(Lo和Wessels，1998)。因此，Cx43-null 小鼠左右心室之間的卵圓孔在出生時不會關閉。因此，Cx43-null 小鼠存活到胎盤循環(huán)結束，此時動物不再充分灌注。為了研究缺乏 Cx43 表達的細胞的特性，我們維持了 Cx43 雜合子的繁殖菌落多年，以便我們可以在分娩后立即從野生型和 Cx43-null P0 幼崽或 E19-20 獲得組織并制備原代細胞培養(yǎng)物通過剖腹產獲得的幼崽(Scemes 等人，1998 年)。該方案成本高昂且效率低下，因為這些轉基因小鼠的繁殖是不規(guī)則的，并且在驗證基因型之前必須從每只小鼠中分別制備細胞培養(yǎng)物。為了避免這些困難，我們投資于產生永生化星形膠質細胞，這對于允許使用具有和不具有 Cx43 表達的培養(yǎng)星形膠質細胞以獲得更高的傳代次數(shù)非常有益，并符合縮寫：ALDH1L1，10-甲?；臍淙~酸脫氫酶; DiI, 1,1-dioctadecyl-3,3,33-tetramethylindocarbocyanine perchlorate; AQP4，水通道蛋白4; bEnd.3 細胞，來自小鼠 ATCC R CRL-2299TM 的腦微血管內皮細胞系; Cx43，連接蛋白43; Cx30，連接蛋白30; Cx26，連接蛋白26; EBFP2，增強型藍色熒光蛋白 2，F(xiàn)RAP，光漂白后的熒光恢復; GS，谷氨酰胺合成酶; GFAP，膠質酸性纖維蛋白; GJ、GLT-1 (EAAT2)、谷氨酸轉運蛋白 1(興奮性氨基酸轉運蛋白 2)：間隙連接; hTERT，人類端粒酶逆轉錄酶; IWCA，永生化的野生型皮質星形膠質細胞; IKOCA，永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞; msfGFP，單體化超級文件夾綠色熒光蛋白; qRT-PCR，定量實時聚合酶鏈反應; sfGFP，超級文件夾綠色熒光蛋白。細胞神經科學前沿| www.frontiersin.org 2 用于實驗動物模型的三個“R”(減少動物數(shù)量、優(yōu)化技術以最大程度地減少疼痛以及在可能的情況下替換動物實驗)，同時節(jié)省時間、金錢并減少實驗室材料浪費。我們用 hTERT 轉導了來自 Cx43-null 和野生型同窩小鼠的皮質星形膠質細胞的原代培養(yǎng)物。如我們之前所述(Thi 等人，2010)，該方法已成功用于生成其他細胞系，包括野生型和 Cx43-null 成骨細胞系。此外，據報道，hTERT 轉導與癌基因轉染相比具有優(yōu)勢，因為它不涉及腫瘤抑制基因的失活(Lee 等，2004)。在這份手稿中，我們報告了源自野生型和 Cx43-null 小鼠的 hTERTimmortalized 星形膠質細胞系的特征，命名為 IWCA 和永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞 (IKOCA) 細胞，關于星形膠質細胞特異性 mRNA 和蛋白質的表達以及幾個不同的功能特性。我們還證明了在 IKOCA 細胞中外源表達的由 Cx43 形成的 GJ 斑塊在外觀上與在野生型原代星形膠質細胞培養(yǎng)物中表達的 GJ 斑塊相似，表明這些細胞系可用于研究細胞和分子操作對星形膠質細胞結構的影響和功能。

研究內容

1.WT 和 Cx43-Null 星形膠質細胞原代培養(yǎng)物中星形膠質細胞標志物表達水平的量化，以及用 hTERT 轉染每種基因型后的通道

在 IWCA 星形膠質細胞中發(fā)現(xiàn) Cx43 轉錄物表達隨著時間的推移相對恒定，并且在 IKOCA 空值中根本無法檢測到(圖 1A)。 Cx30 水平太低，無法在所有通道的兩種基因型中量化(圖 1B)，而 Cx26 豐度在兩種基因型中相對恒定，直至第 10 代(圖 1C)。水通道蛋白 4 (AQP4) mRNA 表現(xiàn)出類似的持續(xù)表達，盡管不同細胞系中的水平差異很大(圖 1D)。我們檢查的其他星形膠質細胞標志物包括谷氨酰胺合成酶 (GS)、醛脫氫酶 1(10-甲?；臍淙~酸脫氫酶，ALDH1L1)、谷氨酸轉運蛋白 1 [GLT-1、人興奮性氨基酸轉運蛋白 2 (EAAT2) 的小鼠直系同源物，也稱為溶質載體家族 1 成員 2 (SLC1A2)] 和膠質纖維酸性蛋白 (GFAP)。 GS、ALDH1L1 和 GFAP 隨著時間的推移，在兩種基因型的培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)其 mRNA 表達水平幾乎恒定(圖 1E、F、H)。 GLT-1 的表達存在于兩種基因型的兩個細胞系中，而在其他 2 個細胞系中低于檢測(圖 1G)。

進行蛋白質印跡和免疫染色以量化蛋白質表達水平并確定 IWCA 和 IKOCA 在第 1-10 段的細胞定位。圖 2A-C 中顯示了代表性通道中 Cx43 的免疫印跡和免疫染色，圖 2A-D 中顯示了 AQP4。在 IWCA 培養(yǎng)物中，Cx43 蛋白水平直到第 5 代才顯著降低，但在第 10 代降低到其初始水平的約 30%(圖 2C)。在免疫染色培養(yǎng)物或從 IKOCA 獲得的免疫印跡中的任何時間點都未檢測到 Cx43。免疫染色和蛋白質印跡均顯示 IKOCA 中的 AQP4 蛋白水平在第 1 代時低于 IWCA 星形膠質細胞，并且從第 1 代開始兩種基因型的 AQP4 蛋白水平逐漸下降;在第 5 代及以后，基礎 AQP4 表達非常低(圖 2D)。還確定了 GFAP 和 GS(其他兩種特征性星形膠質細胞標志物)的表達水平和細胞定位。與圖 1 所示的 mRNA 結果相似，在所有通道的 IWCA 和 IKOCA 中均可檢測到 GFAP 染色(圖 3A、B)，但蛋白質水平隨時間下降(圖 3C)。然而，IKOCA 中 GFAP 蛋白表達的下降比 IWCA 更快，正如 im 所揭示的，在兩種基因型的培養(yǎng)中，隨著時間的推移，mRNA 表達水平幾乎恒定(圖 1E、F、H)。 GLT-1 的表達存在于兩種基因型的兩個細胞系中，而在其他 2 個細胞系中低于檢測(圖 1G)。進行蛋白質印跡和免疫染色以量化蛋白質表達水平并確定 IWCA 和 IKOCA 在第 1-10 段的細胞定位。圖 2A-C 中顯示了代表性通道中 Cx43 的免疫印跡和免疫染色，圖 2A-D 中顯示了 AQP4。在 IWCA 培養(yǎng)物中，Cx43 蛋白水平直到第 5 代才顯著降低，但在第 10 代降低到其初始水平的約 30%(圖 2C)。在免疫染色培養(yǎng)物或從 IKOCA 獲得的免疫印跡中的任何時間點都未檢測到 Cx43。免疫染色和蛋白質印跡均顯示 IKOCA 中的 AQP4 蛋白水平在第 1 代時低于 IWCA 星形膠質細胞，并且從第 1 代開始兩種基因型的 AQP4 蛋白水平逐漸下降;在第 5 代及以后，基礎 AQP4 表達非常低(圖 2D)。

還確定了 GFAP 和 GS(其他兩種特征性星形膠質細胞標志物)的表達水平和細胞定位。與圖 1 所示的 mRNA 結果相似，在所有通道的 IWCA 和 IKOCA 中均可檢測到 GFAP 染色(圖 3A、B)，但蛋白質水平隨時間下降(圖 3C)。然而，免疫印跡顯示，IKOCA 中 GFAP 蛋白表達的下降比 IWCA 更快(圖 3C)。 GS 在 IWCA 和 IKOCA 中顯示出強烈的免疫染色，直到第 10 代(圖 3A，B)。西方免疫印跡檢測到 IWCA 和 IKOCA 培養(yǎng)物中的 GS 明顯增加，直到第 5 代，此后下降(圖 3D)。方差很大，通過 ANOVA 評估，基因型之間或隨時間的差異并不顯著。

Fig. 1. 圖 1 |定量 RT-PCR 顯示轉導后 10 次傳代期間編碼星形膠質細胞蛋白的 mRNA 的表達水平。永生化野生型 (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮質星形膠質細胞系中星形膠質細胞生物標志物的表達水平。在用 hTERT 轉導后最多 10 代的每個時間點測量的表達水平被標準化為轉導前 IWCA 星形膠質細胞的表達水平(在直方圖中標記為第 1 代)。直方圖中的點對應于單個細胞系和條形，方差對應于為兩種基因型中的每一種生成的四個獨立克隆的平均值 ± SE 值。 (A) Cx43 水平在 IWCA 中穩(wěn)定多達 10 代，而在所有 IKOCA 系中均不存在 Cx43 表達。 (B) 在永生化之前或之后的任何時間點，在 IWCA 或 IKOCA 中均未檢測到 Cx30。 (C) Cx26 存在于 IWCA 和 IKOCA 中，并且在兩種基因型中都相對穩(wěn)定，并持續(xù)傳代。 (D) IWCA 和 IKOCA 中 AQP4 轉錄物的水平，第 10 代的最低水平約為原代細胞的 20%。 (E,F) 星形膠質細胞標志物谷氨酰胺合成酶 (GS) 和醛脫氫酶 (ALDH1L1) 的轉錄水平在檢查的 10 代中非常穩(wěn)定。 (G) 谷氨酸轉運蛋白 (GLT1) 的 mRNA 低于原代細胞，但基因型之間相似，并且在兩種基因型的第 5 代后下降，在第 10 代達到不可檢測的水平。(H) 星形膠質細胞中間絲轉錄物 GFAP 的水平是穩(wěn)定的在兩種基因型中，但在第 10 代的兩種 IKOCA 細胞系中含量較低。

圖2. 在前十代中，Cx43 和 AQP4 在 IWCA 和 IKOCA 中的表達水平和定位。 (A,B) 永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮質星形膠質細胞培養(yǎng)物中 Cx43 的免疫染色顯示 IWCA 中的點狀細胞間定位不太豐富，但隨著時間的推移在培養(yǎng)中仍然很突出。 IKOCA 在任何時間點均未顯示 Cx43 免疫染色。 AQP4 的點狀分布表明該蛋白在 IWCA 和 IKOCA 中的第 10 代仍然很好地表達，但降低到非常低的水平。注意：細胞核染色中的點狀染色是非特異性的，可能是 AQP4-C19 抗體的偽影，如前所述 (Thi et al., 2008)。比例尺為 20 μm，圖中所有顯微鏡圖像的比例相同。 (C) 蛋白質印跡顯示 IWCA 中的 Cx43 蛋白水平在第 10 代之前沒有顯著下降，當時其水平降低到原代星形膠質細胞的 30% 左右。 IKOCA 在所有時間點均不存在 Cx43 蛋白表達。 (D) AQP4 蛋白表達非常低，但在第 5 代及以上兩種基因型中均可檢測到。

圖 3 |前十代中 GFAP 和 GS 在 IWCA 和 IKOCA 中的表達水平和定位。 (A,B) IWCA 和 IKOCA 的 GFAP 免疫染色隨著時間的推移而下降。 GS 在所有傳代的 IWCA 和 IKOCA 培養(yǎng)物中均高度表達，但在兩種基因型中的第 5 代均下降。比例尺為 20 μm，圖中所有顯微鏡圖像的比例相同。 (C) GFAP 蛋白水平也隨著逐步傳代迅速下降，IWCA 中的最低水平約為 27%，IKOCA 培養(yǎng)中約為 2%。 (D) GS 蛋白水平在培養(yǎng)中隨著時間的推移而增加，在所有時間點都有些變化。

2. 永生化皮質星形膠質細胞系中 Cx43 功能的評估

我們的永生化程序的主要目標是獲得正常星形膠質細胞和缺乏主要 GJ 蛋白 Cx43 表達的星形膠質細胞，這將為評估 Cx43 在星形膠質細胞行為的多個方面的作用提供一個理想的工具。為了確保功能性 Cx43 表達在永生化星形膠質細胞中持續(xù)多次傳代，我們測量了小熒光染料 LY (MW 444 Da) 和鈣黃綠素 (MW 622 Da) 的細胞間轉移。為了量化與 LY 的耦合強度，我們在融合培養(yǎng)皿中注入了單個細胞。如圖 4A 所示，在第 9-10 代 LY 轉移在 IWCA 之間很常見，從注入的細胞擴散到其相鄰細胞的 13.7 ± 2.8%(圖 4C)，每個字段總共有 535 ± 100 個細胞。 IKOCA 培養(yǎng)物中的 LY 轉移幾乎不存在(圖 4B)，從注入的細胞擴散到僅 1.0 ± 0.1% 的相鄰細胞(圖 4C)，每個字段總共有 102 ± 27 個細胞。染料轉移也使用所謂的“降落傘試驗”進行了評估。在本次檢測中，將載有 GJ 可滲透染料鈣黃綠素和親脂性 GJ 不可滲透膜染料 DiI 的第 7-10 代分離供體細胞逐滴添加到第 7-10 代受體細胞的單層上。在添加供體細胞后 1-2 小時觀察到偶聯(lián)。如圖 4D、G 所示，每個供體 IWCA 細胞在 IWCA 受體培養(yǎng)物中平均招募了 24.36 ± 8.95 個相鄰細胞，證實了 LY 注射試驗的結果，證明 IWCA 在功能上是耦合的。未觀察到 IWCA 和 IKOCA 之間的異細胞偶聯(lián)(圖 4E，G)，并且 Cx43 缺陷型 IKOCA 未顯示同細胞偶聯(lián)(圖 4F，G)。

使用全細胞電壓鉗方法的電生理記錄提供了測量 GJ 介導的耦合的最靈敏和定量的方法，因此揭示的生物物理特性可以指示哪些連接蛋白形成通道(del Corsso 等人，2006)。來自 IWCA(通道 >10)的成對全細胞記錄響應長電壓脈沖顯示，當任一極性的電壓較低時，結電流隨時間保持恒定，但在電壓脈沖高于約 ±40 mV 時電流下降(圖 4H)。結電導的這種微弱但明顯的電壓敏感性與在用 Cx43 轉染的細胞系中測量的相似(Moreno 等，1995)。在 IKOCA(通道 >10)中，耦合的細胞對較少，連接電導低得多(圖 4I)。在 IWCA 中計算的結電導在 17 個細胞對中為 17.5 + 3.2 nS，而在 23 個 IKOCA 細胞對中為 0.36 + 0.18 nS，差異顯著(p < 0.0001)。

染料偶聯(lián)和電生理研究的結果表明 IWCA 保留了形成功能性 Cx43 GJ 通道的能力。在 IKOCA 中，無法形成功能性 Cx43 GJ 預計僅歸因于缺乏 Cx43 表達。為了證明組裝和形成 Cx43 GJ 所需的細胞機制也保留在 IKOCA 中，我們用 GFP 標記的 Cx43 轉染這些細胞，并將 GJ 斑塊形成與 IWCA 的形成進行比較。如圖 5A 所示，GJ 勾勒出 IWCA 的邊緣，但在未轉染的 IKOCA 中完全不存在(圖 5D)。在 IWCA 中，內源性 Cx43 GJ 斑塊在更高放大倍率下觀察時似乎由一些離散的較小斑塊組成(圖 5B，C)。同樣，用 GFP 標記的 Cx43 轉染的 IKOCA 中的 Cx43 斑塊顯示為包含圓形亞基的扁圓結構域(圖 5E，F(xiàn))。圖 5E 中具有較暗但可檢測到的 GFP 信號的細胞區(qū)域代表非連接 sfGFP-Cx43，當使用共聚焦顯微鏡在高放大倍率下以 3D 觀察時，可以識別出主要位于質膜上。 Cx43 的總體表達增加和更大的 GJ 斑塊結構代表了在 IWCA 星形膠質細胞中發(fā)現(xiàn)的外源性連接蛋白和內源性表達的 Cx43 的顯著差異。這些結果表明，Cx43-null 星形膠質細胞的永生化不會損害這些細胞形成 GJ 的能力，并且轉染 GFP 標記的 Cx43 的 IKOCA 中 GJ 斑塊的組織類似于 IWCA 之間內源性表達的 GJ 斑塊。最重要的是，這個發(fā)現(xiàn)表明 IKOCA 細胞系可能是一種有用的底物，其中 Cx43 GJ 及其變體可以在星形膠質細胞背景中表達，以模擬正常細胞環(huán)境為了研究 Cx43 變體表達對細胞生理學和形態(tài)學的影響，不存在內源性 Cx43 表達的混淆。

圖 4 |在融合的皮質星形膠質細胞培養(yǎng)物中評估永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 中的功能 GJ 耦合。 (A) 在第 10 段觀察到的 IWCA 之間的熒光黃 (LY) 染料耦合。左，明亮的視場相襯圖像，帶有疊加的熒光。正確的;帶有星號的熒光圖像，表示微量注射 LY 的細胞;注意在所有直接相鄰的鄰居中檢測到間隙連接介導的染料擴散。比例尺 = 40 μm (B)。在第 10 段 IKOCA 之間未觀察到 LY 染料偶聯(lián)。左側，亮相加熒光顯示注射視野。右圖：在 IKOCA 培養(yǎng)物中，染料不會從注入的細胞擴散到相鄰的相鄰細胞中。比例尺 = 40 μm (C)。 LY 染料在 IWCA 和 IKOCA 培養(yǎng)物中擴散的量化。直方圖對應于每個基因型在第 10 代時在每個基因型的兩個獨立培養(yǎng)物中進行的六次注射的平均值 ± SEM (????p < 0.001)。 (D-F)。降落傘試驗：(D)從 IWCA 第 9 代供體到受體 IWCA 細胞(IWCA-IWCA); (E) 從 IWCA 供體到受體 IKOCA 第 10 代細胞 (IWCA-IKOCA)，和 (F) 從 IKOCA 第 10 代供體到受體 IKOCA 細胞。通過雙鈣黃綠素-DiI(分別為綠色和紅色)標記識別供體細胞。比例尺 = 20 μm (G) 鈣黃綠素染料在 IWCA-IWCA、IWCA-IKOCA 和 IKOCA-IKOCA 供體-受體培養(yǎng)物中的定量。偶聯(lián)被評估為每個供體細胞的偶聯(lián)細胞數(shù)。 (H) 使用 IWCA 和 IKOCA 電池對之間的雙全電池電壓鉗測量的結電流。緩慢的電壓斜坡(插圖，–100 mV 到 +100 mV 超過 5 s)被傳送到單元 1，同時記錄單元 1(I1，上跡線)和單元 2 中的電流(在單元 2 中記錄電流，同時向單元 1 提供電壓與結電流等效，但極性相反，標記為 Ij)。來自 IWCA 對(左下軌跡)的結電流很大，并且顯示出與 Cx43 通道的電壓依賴性一致的電壓非線性。 IKOCA 對的結電流非常小，表明細胞沒有高度耦合。 (I) IWCA 和 IKOCA 電池對中結電導 (gj = Ij/V) 的量化。請注意，與 IKOCA 相比，WCA 中的 gj 明顯更強(17.35 + 3.2 nS，N = 17 vs 0.36 + 0.18 nS，N = 23;p < 0.0001)。

圖 5 |永生化 WT 皮質星形膠質細胞 (IWCA) 中的內源性 Cx43 GJ 斑塊與永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞 (IKOCA) 中由 GFP 標記的 Cx43 形成的 GJ 斑塊的比較。 (A, B) GJ 斑塊 (箭頭) 勾勒出單個 IWCA (由 DAPI 染色的細胞核識別)。比例尺 = 20 μm。 (C) 在更高的放大倍數(shù)下，這些連接區(qū)域看起來有點扁，由緊密堆積的斑塊形成。比例尺 = 5 μm。 (D) 在 IKOCAs 中，內源性 Cx43 連接不存在。 (E) 用 GFP 標記的 Cx43 轉染 IKOCA 細胞誘導形成標記的間隙連接斑塊。比例尺 = 20 μm。 (F) 來自“E”的更高放大率圖像。比例尺 = 5 μm。

3. IKOCA 細胞允許對間隙連接斑塊形態(tài)和與其他細胞器的相互作用進行超分辨率成像

使用 Zeiss 980 Airyscan2 顯微鏡對連接兩個 IKOCA 細胞的 EBFP2-Cx43(圖 6 中免疫染色的綠色)囊泡(綠色斑點)和 GJ 斑塊的位置進行成像，以檢查 GJ 斑塊形態(tài)特征，例如不連續(xù)性和小的相鄰 GJ 斑塊(放大插圖在圖 6A)。請注意圖 6A 中所示 GJ 斑塊邊緣附近的明亮小斑點，其中的形態(tài)讓人想起之前通過電子顯微鏡和其他人在轉化細胞系中觀察到的萌芽內吞 GJ(Bell 等人， 2018)。 GJs 與線粒體以及與其他細胞器之間的相互作用改變了細胞間的通訊(Wang 等人，2013;Kang 等人，2014)。如圖 6 所示，培養(yǎng)物中某些 IKOCA 細胞中 Cx43 的重新表達允許比較 IKOCA 細胞中 Cx43 表達對線粒體位置和形態(tài)的影響。在這里，我們顯示所有線粒體的后固定免疫熒光染色。注意線粒體明顯定位于 EBFP2-Cx43 斑塊區(qū)域(圖 6C 顯示反射性 Cx43 GJ 斑塊，白色箭頭)，該斑塊部分正在進行內吞作用，小線粒體可能位于 GJ 斑塊的大內吞部分(GJ 內體也已知作為連接體)。連接體相關的線粒體在圖 6D 中用黃色箭頭表示。星形膠質細胞膜折疊但未被 GJ 斑塊占據的區(qū)域由圖 6C 中小白色箭頭旁邊的微弱但增強的綠色信號指示。這些數(shù)字突出了 IKOCA 和 IWCA 星形膠質細胞在高分辨率成像中的實用性。

圖 6 | IWCA 和 IKOCA 細胞可用于通過超分辨率顯微鏡研究 GJ 形態(tài)和與其他蛋白質的相互作用。 (A) 當兩個轉染細胞接觸時，IKOCA 第 10 代細胞轉染以重新表達 Cx43，并帶有熒光蛋白標簽(綠色，用針對 Cx43 的抗體進行免疫標記)形成 GJ。如藍色 DAPI 染色所示，在 A 中圖像的場中心有未轉染的細胞與兩個轉染的 IKOCA 細胞接觸，它們不表達 Cx43 并且不形成 GJ(比例尺 = 20 μm)。超分辨率成像可以深入了解 GJ 斑塊和內吞 GJ 斑塊的結構特征，如放大插圖(比例尺 = 2 μm)所示。 (B) 在 IKOCA 細胞亞群中重新表達標記為 Cx43 的熒光蛋白，隨后對所有 IKOCA 細胞(例如線粒體)中存在的次級細胞特征進行免疫染色，從而可以研究 Cx43 表達在星形膠質細胞樣細胞中的影響。細胞培養(yǎng)樣品 - 使用超分辨率顯微鏡(比例尺 = 20 μm)促進 Cx43 和其他細胞器之間相互作用的并排比較和可視化。 (C) 放大 Cx43 GJ 斑塊結構(綠色，用白色箭頭表示)似乎與小線粒體相互作用的位置(用 TOMM20 染色表示，洋紅色)。該 GJ 斑塊代表反射性 GJ 斑塊，該斑塊已在同一星形膠質細胞的質膜重疊處形成，從而允許 GJ 形成。 (D) 與“C”中相同區(qū)域的視圖。移除 Cx43 通道以允許觀察內吞 Cx43 連接體(黃色箭頭)內的 TOMM20 染色 - 提高線粒體轉移可能通過 Cx43 內吞作用發(fā)生的可能性。 (C，D)中的比例尺 = 2 μm。

4. IKOCA 細胞允許對 GJ 和相互作用蛋白進行光學實驗

三維 FRAP(如圖 7A 所示)允許改進對 GJ 內斑塊蛋白遷移率的評估，因為可在 3D FRAP 中檢測到可用于恢復的整個有效(對于此時間尺度)熒光池。其他 GJ 特征的運動，例如當 GJ 的一部分被內吞時形成的不連續(xù)性，可以使用共聚焦顯微鏡在永生化星形膠質細胞中輕松研究。 Cx43 在 GJ 斑塊結構中的排列比其他蛋白質(如 Cx30 和 Cx26)更穩(wěn)定，如先前在轉化細胞系中報道的(Stout 等，2015)。培養(yǎng)的 IKOCA 和 IWCA 細胞薄而扁平的形態(tài)導致它們產生 GJ 斑塊，這些斑塊通常與生長基質(蓋玻片)幾乎平行排列。這些特性使 IKOCA 和 IWCA 細胞成為活體 3D 顯微鏡和 GJ 和細胞內細胞器的超分辨率成像的理想選擇。能夠完全替代 IKOCA 細胞中缺失的 Cx43 表達帶有熒光蛋白標記的 Cx43 允許在兼容的顏色通道中共表達帶有熒光蛋白標記的其他感興趣的蛋白質。圖 7B 顯示了一對 IKOCA 細胞的 3D 延時圖像的正交最大強度投影，該細胞由正在部分經歷的藍色熒光(偽洋紅色)EBFP2-Cx43 GJ 斑塊連接內吞作用。細胞與 msfGFP-ATG9A(綠色)共轉染。 ATG9A 先前被證明與 Cx43 的內吞過程相互作用并共定位于質膜(Bejarano 等人，2014)，但 ATG9A 陽性的小囊泡樣結構明顯轉移到 Cx43 GJ 斑塊的部分。內吞作用起始點(圖 7B，放大插圖)以前沒有報道過，并且在沒有 IKOCA 細胞的情況下很難在星形膠質細胞樣細胞中觀察到。

圖 7 | IKOCA 細胞中修飾的 Cx43 轉基因的表達可以在沒有內源 Cx43 表達的混雜影響的情況下實時可視化，并允許測試 Cx43 突變體的表達和其他處理對 IWCA 的影響。 (A) sfGFP-Cx43 和其他熒光蛋白標記的連接蛋白的表達允許 3D 時間推移 FRAP 實驗來檢查星形膠質細胞樣細胞中的 GJ 斑塊動力學 (IKOCA 第 18 段)。星形膠質細胞的薄形態(tài)有助于 3D、延時 FRAP，因為 GJ 斑塊通常與成像焦平面幾乎平行地形成。對于所示的示例圖像，使用 11 個共焦平面對 GJ 的整個垂直寬度進行成像，每個堆棧以 3 秒的間隔采集。由此產生的 Z 堆疊被折疊成一系列最大投影重建，以可視化整個斑塊結構隨時間的熒光恢復。比例尺 = 2 μm。 (B) EBFP2-Cx43 與綠色熒光蛋白標簽和傳感器的表達允許對 Cx43 和其他細胞成分(如 msfGFP-ATG9A)之間的相互作用進行實時 4D 檢查，顯示為延時蒙太奇的最大投影(IKOCA 第 16 段，比例尺條 = 5 μm)。請注意，EBFP2-Cx43 GJ 斑塊以洋紅色顯示，msfGFP-ATG9A 自噬蛋白以綠色顯示。放大的插圖顯示了 IKOCA 星形膠質細胞中轉基因表達的 Cx43 和 ATG9A 之間動態(tài)相互作用的細節(jié)。插入比例尺 = 1 μm。

5.通過與 IWCA 的共培養(yǎng)增強了內皮單層中的屏障形成

為了評估永生化星形膠質細胞系是否保留其與內皮細胞功能相互作用的能力，如在血腦屏障水平上觀察到的，我們對與內皮 bEnd.3 細胞共培養(yǎng)的 IWCA 進行了研究?；谑褂?CellZscope 設備監(jiān)測數(shù)天的跨內皮電阻 (TEER) 的發(fā)展來評估屏障形成。如圖 8 所示，有和沒有 IWCA 的 bEnd.3 內皮細胞培養(yǎng)物的 TEER 隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。然而，從測量開始并持續(xù)到第 7 天，使用 IWCA 培養(yǎng) bEnd.3 細胞的 TEER 顯著高于單獨使用 bEnd.3 或與 IKOCA 一起培養(yǎng)的 TEER(p 值 < 0.05)。從第 1 天開始， TEER (Ohm cm2) 的與 IWCA 的共培養(yǎng)顯著高于單獨的 bEnd.3 細胞 (7.31 ± 1.13 vs 1.67 ± 0.28, p = 0.00024) 和 IKOCA 與 bEnd.3 (7.31 ± 1.13 vs 4.33 ± 0.63, p = 0.033)。在第 7 天，與單獨的 bEnd.3 細胞(23.17 ± 2.60 vs 9.34 ± 0.86，p = 0.00027)和 IKOCA 與 bEnd.3(23.17 ± 2.60 vs 12.56 ± 1.13，p = 0.0022)相比，差異仍然存在。這些 IWCA 共培養(yǎng) TEER 值與其他人先前在使用連接到 EVOM 電阻計 (Srinivasan) 的 Endohm 室與原代大鼠星形膠質細胞共培養(yǎng) 5 天時報告的值相似等人，2015)。

圖8. Transwell 電阻 (TEER) 在單獨的 bEnd.3 內皮細胞和與永生化 WT (IWCA) 和 Cx43-null (IKOCA) 皮質星形膠質細胞的共培養(yǎng)中測量。使用 CellZscope 測量單獨 bEnd.3 細胞的 transwell 培養(yǎng)物以及與 IWCA 和 IKOCA 共培養(yǎng)物的電阻增加。 N = 11-17 個單獨的實驗。通道數(shù)范圍為 15-30。 ???p < 0.01, ???p < 0.001, ????p < 0.0001 表示與單獨的 bEnd.3 單元格相比的顯著性。 ∧p < 0.05, ∧∧p < 0.01, ∧∧∧p < 0.001, ∧∧∧∧p < 0.0001 表示相對于 bEnd.3 + IKOCA 的顯著性?；旌闲治鲇糜跍y試每個時間點的顯著性。

材料方法

細胞培養(yǎng)我們使用源自 19-20 日齡 (E19-20) 野生型 (WT) 和 Cx43-null 小鼠胚胎(C57Bl/6J-Gja1 菌株中 Cx43 雜合子的后代，最初從杰克遜實驗室獲得)的皮質星形膠質細胞的原代培養(yǎng)物.動物在阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學院動物設施中飼養(yǎng)，所有實驗程序均經學院動物護理和使用委員會批準，并使用先前描述的星形膠質細胞培養(yǎng)方法(McCarthy 和 de Vellis，1980)的修改進行。從全腦 E19-E20 胚胎中分離皮質，去除腦膜后，將組織切碎并酶消化(0.05% 胰蛋白酶，37°C 10 分鐘)。通過離心收集來自每只動物的細胞并將顆粒懸浮在星形膠質細胞培養(yǎng)基 [ScienCell Research Laboratory (SCRL), cat# 1801] 中，輔以 2% 胎牛血清 (FBS) (SCRL cat# 0010)、1% 青霉素/鏈霉素 ( SCRL cat# 08030) 和 1% 星形膠質細胞生長因子 (SCRL cat# 1852)，接種在塑料培養(yǎng)皿中，然后在 37°C 下?lián)u動過夜，以去除培養(yǎng)物中的非星形膠質細胞。從每只小鼠幼崽獲得的星形膠質細胞培養(yǎng)物的基因型通過對尾部 DNA 的 PCR 來確定，如所述(Dermietzel 等，2000)。星形膠質細胞在培養(yǎng)中保持 10-14 天(100% 濕度;95% 空氣/5% CO2，37°C)直到匯合，此時細胞像我們之前描述的成骨細胞那樣永生化(Thi et al., 2010)。

永生化

我們使用人類端粒酶逆轉錄酶 (hTERT) 過表達系統(tǒng)來實現(xiàn)星形膠質細胞的永生化。 hTERT cDNA 從其原始構建體 hTERTpGRN145(ATCC，MBA-141;馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國)進行 PCR 擴增，并亞克隆到 pLentiV5-EF1α 載體(從購買自 Invitrogen，cat#V49,610 的原始載體修改)。用含有 hTERTcDNA 9×105 轉導單位(TU;顆粒/ml)的慢病毒顆粒轉導 WT 和 Cx43-null 星形膠質細胞的匯合培養(yǎng)物。過夜溫育后，將混合物更換為星形膠質細胞培養(yǎng)基。我們使用星形膠質細胞生長補充劑 (SCRL# 1,852)。選擇該補充劑用于我們的小鼠細胞培養(yǎng)是因為它是專為星形膠質細胞培養(yǎng)(特別是人類星形膠質細胞)而設計的市售補充劑，我們打算開發(fā)平衡廣泛實用性、方便性和與體內星形膠質細胞相似性的細胞培養(yǎng)方法。然后通過每兩個月連續(xù)分裂來選擇永生化細胞，從而根除不繼續(xù)分裂的細胞。用 hTERT 病毒顆粒成功轉導的細胞被指定為從第二代開始永生化，因為原代星形膠質細胞在第二代之后生長非常差。在不同的窩中獨立進行四次永生化過程，以產生四個永生化 WT 皮質星形膠質細胞 (IWCA) 細胞系和四個永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞 (IKOCA) 細胞系。

定量聚合酶鏈反應

根據制造商的說明，在 Applied Biosystems 7,300 實時 PCR 系統(tǒng)(Forester City，CA，United States)中使用 SYBR GREEN Master Mix(Applied Biosystems)進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。簡而言之，使用 SuperScript VILO cDNA Synthesis (Invitrogen) 將 2 μg 總 RNA 逆轉錄為 cDNA。擴增進行了 40 個循環(huán)，退火溫度為 60°C，最終體積為 25 μl。最后，通過從 60°C 到 95°C 的溫度梯度獲得 PCR 產物的解離曲線。用于 qPCR 的引物列于表 1。擴增了四個永生化 WT 和 Cx43-null 星形膠質細胞系中的每一個的兩個技術復制品。使用 Ct 方法計算分析的 mRNA 樣品的相對基因表達水平，其中獲得的感興趣基因的值首先標準化為參考、管家基因、β-肌動蛋白的值，然后標準化為它們各自對照的值(非 hTERT 永生化細胞 - 第 1 代)。正如我們之前的研究(Thi et al., 2010)，比較 Ct 方法的驗證是在對連續(xù)樣品稀釋度的目標和參考擴增 [Ct (Cttarget – Ctreference)] 的效率相等后獲得的。保留早期傳代的細胞并選擇較晚的傳代，如用于比較生物標志物表達的指示。

蛋白質印跡分析

溶解鋪在 100 mm 培養(yǎng)皿中的匯合星形膠質細胞培養(yǎng)物，將等量的總蛋白加載到 7.5 或 10% SDS-PAGE 凝膠上進行分離，然后電泳轉移到硝酸纖維素膜(Whatman，Dassel，Germany)上。用針對兔抗 Cx43 的多克隆抗體探測膜，1:10,000(Sigma，cat# C6219);小鼠抗 GFAP 1: 500 (Sigma cat# G3893)、山羊抗 GS 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-6640) 和山羊抗 AQP4 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-9888) ，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗山羊 IgG、山羊抗兔 IgG 和山羊抗小鼠(1:10,000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, United States cat# SC-2020, SC -2004 和 SC-2005)。使用 Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (EMD Millipore, MA, United States catalog# WBKLS0100) 檢測蛋白質條帶，并使用 In Vivo FX PRO 成像系統(tǒng) (Carestream, Carestream, NY, United States) 獲取圖像。

染料偶聯(lián)

我們使用了熒光黃 (LY) 的染料注射和加載 calcein-AM 的供體細胞的所謂“降落傘測定”來評估 GJ 介導的中等大分子(LY = 444 Da;calcein = 622 Da)的細胞間擴散。在相似匯合的星形膠質細胞培養(yǎng)物中進行染料注射。 LY 被離子電滲(0.1 μA 的連續(xù)電流)使用靜電計(3100 型;A-M 系統(tǒng))使用充滿染料的鋒利微電極(LY，150 mM LiCl 中的 5% wt;電阻 ~100 MOhms)進入單細胞。取出微量移液器后，立即使用一個 CoolSNAP-HQ2 CCD 相機(Photometrics，Tucson，AZ，美國)連接到帶有 10X 干物鏡(數(shù)值孔徑 0.3)和 FITC 濾光片組的 Nikon 倒置顯微鏡。對 LY 注射細胞周圍的熒光細胞進行計數(shù)，然后將這些值通過注入的感興趣區(qū)域 (ROI) 內的細胞總數(shù)進行歸一化，并表示為每個 ROI 的耦合細胞百分比。降落傘試驗基本上按照所述進行(Stains 和 Civitelli，2016;McCutcheon 等人，2020a)。簡而言之，培養(yǎng)中的細胞通過胰蛋白酶消化(Thermo Fisher Scientific，#25200056)分離，用 10 μM calcein-AM(Thermo Fisher Scientific，#C3100MP)懸浮加載，并用親脂性 GJ 不滲透染料 DiI(Sigma Aldrich，# 468495-100MG) 30 分鐘，以區(qū)分降落傘供體細胞和受體細胞。然后用 Dulbecco 的磷酸鹽緩沖液 (DPBS, Mediatech, Cellgro, VA, United States) 沖洗供體細胞并離心兩次以去除殘留染料，然后加入未標記受體細胞的匯合單層中。對于配對的 IWCA-IWCA、IKOCA-IKOCA 和異細胞 IWCA-IKOCA，確定了與用 GJ 滲透性鈣黃綠素染料染色的供體細胞相鄰的受體細胞數(shù)。該分析既是對 LY 注射的確認又是補充，因為它取決于 GJ 形成的速率和所形成的 GJ 的滲透性。

電耦合

雙全細胞電壓鉗技術用于表征 IWCA 和 IKOCA 細胞的結電導，如所述 (del Corsso et al., 2006)。在 0 mV 的保持電位下對星形膠質細胞進行電壓鉗位，并將 8-10 秒的持續(xù)時間命令步驟 (V) 以 20 mV 的增量從 -110 到 +110 mV 或從 -100 到 +100 mV 呈現(xiàn)給一個細胞使用 pClamp 軟件(Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA，United States)。在一些實驗中，使用了電壓斜坡協(xié)議，其中電壓從 -100 緩慢增加到 +100 mV。在未步進的電池中記錄結電流 (Ij)，結電導 (Gj) 計算為 -Ij/V (del Corsso et al., 2006)。貼片移液器裝有(以 mM 為單位)140 CsCl、10 EGTA 和 5 Mg2ATP，pH 7.25。將細胞浸泡在含有(以 mM 計)140 NaCl、2 KCl、2 CaCl2、1 BaCl2、2 CsCl、1 MgCl2 和 5 HEPES，pH 7.2 的溶液中。 CoolSNAP-HQ2 CCD 相機(Photometrics，Tucson，AZ，United States)連接到帶有 10X 干物鏡(數(shù)值孔徑 0.3)和 FITC 濾光片組的 Nikon 倒置顯微鏡。對 LY 注射細胞周圍的熒光細胞進行計數(shù)，然后將這些值通過注入的感興趣區(qū)域 (ROI) 內的細胞總數(shù)進行歸一化，并表示為每個 ROI 的耦合細胞百分比。降落傘試驗基本上按照所述進行(Stains 和 Civitelli，2016;McCutcheon 等人，2020a)。簡而言之，培養(yǎng)中的細胞通過胰蛋白酶消化分離(Thermo Fisher Scientific，#25200056)，加入 10 μM calcein-AM(Thermo Fisher Scienticic，#C3100MP)懸浮液，并用親脂性 GJ 不滲透染料 DiI(Sigma Aldrich，# 468495-100MG) 30 分鐘，以區(qū)分降落傘供體細胞和受體細胞。然后用 Dulbecco 的磷酸鹽緩沖液 (DPBS, Mediatech, Cellgro, VA, United States) 沖洗供體細胞并離心兩次以去除殘留染料，然后加入未標記受體細胞的匯合單層中。對于配對的 IWCA-IWCA、IKOCA-IKOCA 和異細胞 IWCA-IKOCA，確定了與用 GJ 滲透性鈣黃綠素染料染色的供體細胞相鄰的受體細胞數(shù)。該分析既是對 LY 注射的確認又是補充，因為它取決于 GJ 形成的速率和所形成的 GJ 的滲透性。電耦合 雙全細胞電壓鉗技術用于表征 IWCA 和 IKOCA 細胞的結電導，如所述 (del Corsso et al., 2006)。在 0 mV 的保持電位下對星形膠質細胞進行電壓鉗位，并將 8-10 秒的持續(xù)時間命令步驟 (V) 以 20 mV 的增量從 -110 到 +110 mV 或從 -100 到 +100 mV 呈現(xiàn)給一個細胞使用 pClamp 軟件(Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA，United States)。在一些實驗中，使用了電壓斜坡協(xié)議，其中電壓從 -100 緩慢增加到 +100 mV。在未步進的電池中記錄結電流 (Ij)，結電導 (Gj) 計算為 -Ij/V (del Corsso et al., 2006)。貼片移液器裝有(以 mM 為單位)140 CsCl、10 EGTA 和 5 Mg2ATP，pH 7.25。將細胞浸泡在含有(以 mM 計)140 NaCl、2 KCl、2 CaCl2、1 BaCl2、2 CsCl、1 MgCl2 和 5 HEPES，pH 7.2 的溶液中。

熒光蛋白標記的 Cx43 的瞬時外源表達

永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞用 superfolderGFP 標記的 Cx43、msfGFP-rCx43、EBFP2rCx43、sfGFP-Cx30、sfGFP-Cx26 轉染(Stout 等人，2015;Stout 和 Spray，2016 ) 和 msfGFP-ATG9A。這恢復了 Cx43 表達，以允許將外源表達的 Cx43 聚集體與原代 WT 星形膠質細胞培養(yǎng)物中的內源表達斑塊進行比較。在補充有 10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素(Thermo Fisher Scienticic，#15070063)的 DMEM(Thermo Fisher Scientic，#11885084)中將細胞接種到 50-60% 的融合度。轉染前兩小時，更換培養(yǎng)基。對于轉染，1 μg DNA 與 100 μL Opti-MEM(Thermo Fisher，#31985062)和 5 μL 轉染試劑(Mirus TransIT LT1，#MIR2300)和室溫孵育 20-30 分鐘。然后將脂質體-DNA 復合物逐滴添加到 IKOCA 單層中，并在標準培養(yǎng)條件下孵育 2-4 天，無需更換培養(yǎng)基，然后成像。

共聚焦顯微鏡分析星形膠質細胞蛋白的分布并比較內源性

Cx43 連接與熒光蛋白標記的 Cx43 形成的連接 為了評估 WT 和 Cx43null 原代星形膠質細胞和永生化細胞系中的蛋白質定位，將培養(yǎng)物鋪在蓋玻片上，用 4% 多聚甲醛固定( PFA)，用 0.4% Triton-X100 透化，并用 2% 驢血清封閉 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, United States)，如前所述 (Scemes et al., 2000)。然后將細胞與針對兔抗 Cx43 的一抗以 1:1,000(Sigma，cat# C6219)孵育;小鼠抗 GFAP 1: 500 (Sigma cat# G3893)、山羊抗 GS 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-6640) 和山羊抗 AQP4 1:500 (Santa Cruz, cat# SC-9888) ，以及與 Alexa-488 goatanti-mouse IgG (cat#A11001)、Alexa Fluor 594 Donkey Anti-goat (cat#A-11058) 和 Alexa-488 goat anti-rabbit IgG (cat#A-11034) 偶聯(lián)的二抗( 1:1000，英杰公司)。將蓋玻片安裝在載玻片上，在具有 40 倍水浸物鏡的 Zeiss LSM 510 DUO 激光掃描共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss)上進行檢查。堆疊圖像以 0.6 μm z 軸步長連續(xù)拍攝。

如上所述，Cx43 在透化細胞中用原代兔多克隆抗體(1:1000;Abcam，#ab11370)進行免疫標記，或者通過轉染細胞中 GFP 標記的 Cx43(綠色熒光蛋白)的熒光信號進行識別。使用蔡司 LSM 880 倒置顯微鏡和 63 倍油鏡(數(shù)值孔徑，1.4)獲得圖像采集和免疫標記的連接斑塊的 z 堆棧。使用蔡司 5Live Duo 和 63 倍油浸物鏡在 37°C 下獲得活細胞中外源表達 GFP 標記的 Cx43 的 GJ 斑塊的 Z 堆疊?；罴毎某上窠橘|是不含酚的 DMEM(Thermo Fisher Scientic，#31053028)，輔以 10% FBS、1% PS 和 25 mM HEPES(Thermo Fisher Scientic，#15630080)。

通過免疫熒光共染色轉染表達熒光蛋白標記連接蛋白的 IKOCA 細胞成像

永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞在 Ibidi 8 孔 ibiditreat 載玻片 (Ibidi Inc.) 中生長，然后用 EBFP2-Cx43 轉染，然后轉染 48轉染后 h，將其在 4% PFA 中固定 10 分鐘，用 0.4% Triton-X100 透化，用 2% 驢血清封閉，然后使用兔抗 Cx43 抗體進行免疫染色(圖 6A，Sigma，cat#C6219，1:500 ) 或與 Alexa Fluor 488 偶聯(lián)的針對綠色熒光蛋白的羊駝抗體(也標記 EBFP2，圖 6B，Chromotek，cat# gb2AF488，1:100 稀釋)，以增強綠色通道中的 EBFP2 信號連同 DAPI(藍色染色細胞核)。為了共同標記線粒體，我們用 TOMM20 一抗(Invitrogen，cat# MA5-32148, 1:500)染色，然后用驢抗兔 Alexa Fluor 647 進行二次染色(圖 6B，Invitrogen，cat# A-31573, 1： 500)。我們用 Alexa 488 山羊抗兔 IgG(Invitrogen，cat# A-11034, 1:500)對圖 6A 中的細胞進行染色。一抗標記在室溫下攪拌 1 小時，然后在 4 度下過夜。二抗染色在室溫下攪拌 3 小時。圖 6 中的圖像是使用配備 63 × 1.4NA Plan-Apochromat 油浸物鏡的 Zeiss 980 Airyscan2 激光掃描顯微鏡拍攝的。圖 6B 中的縮小圖像具有綠色通道的非線性強度查找表，以允許讀者同時看到非常密集標記的反射 GJ 斑塊和非結膜定位的 Cx43。所有其他圖像查找表都按信號強度線性縮放。

通過瞬時轉染對表達熒光蛋白標記蛋白的 IKOCA 細胞進行光漂白實驗后的實時成像和熒光恢復 永生化 Cx43-null 皮質星形膠質細胞在 Ibidi 8 孔腔載玻片中生長，如前幾節(jié)所述轉染。 sfGFP-Cx43、sfGFP-Cx30 和 sfGFP-Cx26 如前所述用于其他細胞類型(Stout 等人，2015)。將細胞轉移到不含酚紅的 DMEM 中含有 10% FBS、25 mm HEPES 和 2 mm 谷氨酰胺的成像介質中。圖 7 中的現(xiàn)場實驗是在配備 63 × 1.4 NA 物鏡的 Zeiss 5live Duoscan 510 共焦激光掃描顯微鏡上進行的。 3D FRAP 實驗是通過將 11 平面 Z 堆棧采集集中在 GJ 斑塊上然后每 3 秒采集 11 平面 3D 圖像來進行的。使用 488 nm 激光以 100% 進行條紋光漂白，重復三次。將生成的 3D 延時圖像轉換為最大投影正交重建，以生成圖 7A 中的單平面延時圖像系列。對于圖 7B，IKOCA 細胞與 EBFP2Cx43 (McCutcheon 等人，2020b) 以及在氨基末端標記的人類 ATG9A 與標準亞克隆技術產生的單體超折疊 GFP (msfGFP) 共轉染，可根據要求提供質粒序列。然后用 11 個平面 Z 堆棧采集對細胞進行成像，每個焦平面依次成像藍色和綠色通道。生成的雙色 3D 延時被折疊為最大投影正交投影的延時序列，以顯示在圖 7 中。

測量 IWCA-內皮共培養(yǎng)物的屏障形成) DPBS 中的溶液。在 95% 空氣/5% CO2 的加濕培養(yǎng)箱中，在 37°C 下培養(yǎng)涂層刀片 1 小時。 IWCA 是然后以 30,000 個細胞/cm2 的密度接種，讓細胞粘附在 FN 涂層的 Transwell 插入物上 2 小時，然后再次翻轉插入物并放入 12 個多孔板中，IWCA 細胞現(xiàn)在面向板的底部, 并在 DMEM 中培養(yǎng) 2 天。然后將小鼠腦內皮細胞(bEnd.3 細胞，ATCC CRL-2299，馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國)以 60,000 個細胞/cm2 的密度接種在插入物的腔側，并在 DMEM 中生長。沒有 IWCA 的伴侶插入物單獨接種 bEnd.3，以比較它們的屏障功能與共培養(yǎng)物的屏障功能。使用 cellZscope 系統(tǒng)(Nanoanalytics，Munster，Germany)測量內皮單層的跨內皮電阻 (TEER) 和內皮單層與 IWCA 的共培養(yǎng)物，用于自動、長期監(jiān)測屏障電阻。將每個接種有細胞的插入物放入充滿培養(yǎng)基 (DMEM – 10% FBS) 的腔室中，并將腔室支架移至培養(yǎng)箱 (37°C, 5% CO2) 并連接到控制器。 CellZscope 軟件每 6 小時測量一次 TEER。每 3 到 4 天更換一次室中的培養(yǎng)基和插入物，在插入物上接種 bEnd.3 細胞后監(jiān)測 TEER 長達 7 天。

統(tǒng)計分析 GraphPad Prism 8 和 9.0.1 軟件用于數(shù)據和統(tǒng)計分析。

數(shù)據表示為平均值 ± SEM，在 *P < 0.05 時被認為具有統(tǒng)計學意義。通過染料注射分析的未配對學生 t 檢驗確定統(tǒng)計差異。單因素方差分析和 Dunnett 的多重比較測試用于蛋白質印跡分析和降落傘染料轉移測定?；旌闲治鲇糜谠诿總€時間點比較組間的 TEER。

結論與討論

與 IWCA 的共培養(yǎng)顯著高于單獨的 bEnd.3 細胞 (7.31 ± 1.13 vs 1.67 ± 0.28, p = 0.00024) 和 IKOCA 與 bEnd.3 (7.31 ± 1.13 vs 4.33 ± 0.63, p = 0.033)。在第 7 天，與單獨的 bEnd.3 細胞(23.17 ± 2.60 vs 9.34 ± 0.86，p = 0.00027)和 IKOCA 與 bEnd.3(23.17 ± 2.60 vs 12.56 ± 1.13，p = 0.0022)相比，差異仍然存在。這些 IWCA 共培養(yǎng) TEER 值與其他人先前在使用連接到 EVOM 電阻計 (Srinivasan) 的 Endohm 室與原代大鼠星形膠質細胞共培養(yǎng) 5 天時報告的值相似等人，2015)。

間隙連接介導的細胞間通訊在 IWCA 線中得到維持，在 IKOCA 線中非常低。 關于小分子量染料的轉移，細胞內注射的 LY 和加載酯的鈣黃綠素對細胞之間的連接具有高度滲透性。 電耦合的電生理測量發(fā)現(xiàn) IWCAcell 對之間的結電導平均為 17nS，這與我們之前在這些細胞的原代培養(yǎng)物中報道的 13nS 的值相似(Dermietzel 等人，2000)。結電導的電壓敏感性獨特的生物物理特性 由每個連接蛋白形成的 GJ 與 Cx43 所報道的相似(Dermietzel etal2000)

允許哺乳動物細胞在培養(yǎng)物中長時間維持的方法的開發(fā)是開創(chuàng)細胞生物學領域的一項重大成就和細胞神經科學。與致癌轉化的細胞系相比，來自某些組織的細胞類型在培養(yǎng)中仍然更難提取和維持。從組織中提取的大多數(shù)分化的原代細胞在衰老之前經歷了有限數(shù)量的細胞分裂，因此需要連續(xù)收集細胞以維持從組織中分離出來的材料的供應以進行研究。最常用的轉化細胞系對細胞生物學研究做出了巨大貢獻，但也存在許多眾所周知的缺點，包括細胞表型、信號通路和細胞間相互作用特征的重大變化。因此，需要獲得連續(xù)分裂并且還表達與感興趣的細胞類型相似的表型的細胞系。

獲得永生化細胞系的常規(guī)方法涉及從腫瘤中分離細胞 [參見 (Souza et al., 2016)，最初產生的細胞系示例(早于 1960 年)是小鼠肺細胞系 (L1)，得到高度討論和廣泛使用的人宮頸細胞系 [HeLa; (Lucey et al., 2009)] 和中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)]，但此后已有數(shù)千種其他細胞系來源于腫瘤并在某種程度上進行了表征?，F(xiàn)在已知這些細胞系來自表達癌基因的細胞。 HeLa 細胞被人乳頭瘤病毒 (HPV) 感染，該病毒會合成使腫瘤抑制分子 p53 和其他分子失活的蛋白質 (Lechner et al., 1992)。

對腫瘤發(fā)生機制的研究利用了 SV40，這是一種在用于生產脊髓灰質炎病毒疫苗的猴子細胞系中發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒。 SV40 感染猴子細胞，激活早期和晚期基因的表達，并且不會在猴子體內產生腫瘤。在嚙齒動物細胞中，SV40 產生大小 T 抗原以抑制 pRb 和 p53 以及蛋白磷酸酶 (PP2A) (Ahuja et al., 2005)。在小鼠中，SV40 病毒感染導致腫瘤的誘導，并已被用于生成許多廣泛使用的小鼠細胞系 [在 Hudson 和 Colvin (2016) 中進行了綜述]。在細胞培養(yǎng)中，SV40 感染導致細胞轉化，通常被測定為失去接觸抑制生長、在軟瓊脂中生長的能力和生存所需血清的減少。目前使用的大多數(shù)細胞系都是通過這種方法產生的，因此表現(xiàn)出轉化的表型。例如，American Tissue Cell Collection 存儲庫包含七個星形膠質細胞系。其中一種 DI TNC-1，通過 GFAP 靶向癌基因遞送至新生大鼠間腦星形膠質細胞(Radany 等，1992)獲得，具有低水平的內源性水通道蛋白，因此已成為研究在星形膠質細胞中表達的外源性構建體的有用模型-相似的轉化細胞系[例如，(Mola et al., 2016)]。甚至可以在市場上購買專門針對此類研究定制的產品1。

用于原代細胞永生化的較新的替代方法是摻入 hTERT，它保留了端粒的長度，從而賦予細胞自我更新的特性。 hTERT 引入與使用病毒蛋白進行永生化相比具有優(yōu)勢，因為它不涉及腫瘤抑制基因的失活，從而繞過轉化的表型(Kogan 等，2006)。因此，hTERT 永生化產生的細胞通常比病毒轉化細胞更類似于原代細胞，盡管這兩種永生化方法都逃脫了衰老前有限數(shù)量的細胞周期，并且可能無法完全模仿它們來源的細胞的特性.

大多數(shù)使用細胞系評估 GJ 表達對星形膠質細胞表型影響的研究都使用了 C6 神經膠質瘤細胞 (ATCC #CCL-107)。該細胞系來源于亞硝基甲基脲暴露產生的大鼠腦腫瘤，最初的特征是富含 S100 蛋白和紡錘形(Benda 等，1968)。 C6 細胞系廣泛用于膠質母細胞瘤侵襲的研究，因為它在體內形成健壯的腫瘤。它被描述為包含兩種細胞群，一種具有未成熟少突膠質細胞的標志物，另一種是少突膠質細胞和未成熟星形膠質細胞的混合物(Coyle，1995)。值得注意的是，GFAP 表達不存在并且波形蛋白表達在 C6 神經膠質瘤細胞中是可變的 (Chou et al., 2003)。關于 GJ 研究，發(fā)現(xiàn) C6 神經膠質瘤細胞比星形膠質細胞表達更少的 Cx43，并且被認為嚴重缺乏交流(Naus 等，1991)。在許多研究中，據報道，這些細胞中 Cx43 的過表達會降低體內腫瘤生長速率和培養(yǎng)中的細胞增殖 [參見 (Zhu et al., 1992)]。然而，C6 細胞與星形膠質細胞形成功能性 GJ (Zhang et al., 1999)，最近大量研究表明，通過 Cx43 通道的 GJ 通訊在膠質母細胞瘤侵襲中起主要作用 [參見 (Umans and Sontheimer, 2018)]。對原代小鼠星形膠質細胞培養(yǎng)物觀察到相反的效果(從 Cx43 缺失小鼠中提取的星形膠質細胞增殖減少)(Naus 等人，1997;Dermietzel 等人，2000)。我們在此報告的成對 Cx43-null 和 WT 星形膠質細胞的多個系(其他星形膠質細胞蛋白的表達有所不同)將有助于闡明這些與 Cx43 表達對星形膠質細胞增殖相關的有趣發(fā)現(xiàn)，因為 Cx43 的突變形式可以在IKOCA 細胞(如圖 5-7 所示)剖析 Cx43 對細胞生長影響的機制基礎，特別是在沒有當前基因組編輯技術固有的潛在脫靶效應的完全 Cx43 無效背景下。

很少有與腫瘤發(fā)生問題直接相關的研究對源自 Cx43 缺陷星形膠質細胞的星形膠質細胞進行。然而，很明顯，在 C6 細胞中操縱 Cx43 表達可能會產生與星形膠質細胞截然不同的后果。例如，在一項比較 WT C6 細胞與三個 Cx43 轉染克隆的基因表達水平的研究中，發(fā)現(xiàn)只有七個不同的基因被上調或下調(Naus 等，2000)。在轉錄組范圍的研究中，比較來自 WT 小鼠的星形膠質細胞與來自 Cx43-null 小鼠的星形膠質細胞(Iacobas 等人，2003)或用 siRNA 敲低 Cx43 后(Iacobas 等人，2008)，數(shù)百個基因被上調或下調。 Cx43-null 和 Cx43 敲低星形膠質細胞中的基因調控在某種程度上相似(Iacobas 等，2008)，但在 Cx43null 或 Cx43 敲低星形膠質細胞中，在轉染的 C6 細胞中鑒定的基因都沒有受到調控。使用 hTERT 使我們描述的星形膠質細胞系永生化預計比致癌基因誘導的細胞轉化具有更少的副作用信號網絡，但應該注意的是 Park 等人。 (2009) 報道 hTERT 表達可以調節(jié) Wnt 通路。未來研究的一個有希望的領域可以通過 LoxP 或 CRISPR-Cas9 介導的切除 IWCA 和 IKOCA 細胞中使用的轉基因來檢查 hTERT 轉基因和外源表達對 Wnt 和下游途徑的影響。重要的是，本研究中表征的多個細胞系和重新表達 Cx43 的能力將允許通過多個細胞系進行更可靠的研究，并控制 Cx43 在其他細胞途徑上的表達 [Cx43 和 Wnt 途徑之間存在強烈的相互相互作用(范德Heyden et al., 1998; Ai et al., 2000; Hou et al., 2019; Lopez et al., 2019)]。

這里開發(fā)的細胞系表現(xiàn)出原代星形膠質細胞的特征，并且有望為評估星形膠質細胞 GJ 的作用提供新的機會，而不是來自膠質母細胞瘤或其他腫瘤的細胞。例如，未來研究結合伙伴及其對星形膠質細胞蛋白的親和力(McCutcheon 等人，2020b)可能更類似于在更自然的環(huán)境下在體內發(fā)生的研究(盡管 IKOCA 中存在 Cx26 表達)應考慮文化)。還必須考慮的是，我們發(fā)現(xiàn)永生化星形膠質細胞系、Cx43 基因型之間以及傳代數(shù)之間在一些已知在體內星形膠質細胞中表達的蛋白質的表達方面存在很大差異。鑒于在原代細胞培養(yǎng)中觀察到的星形膠質細胞與體內表達水平相比存在顯著的基因和蛋白質表達水平差異，這一發(fā)現(xiàn)并不令人驚訝。此外，星形膠質細胞基因表達在發(fā)育過程中、皮質亞區(qū)域之間，甚至大腦皮層同一區(qū)域的不同層之間存在已知的異質性(Batiuk 等人，2020 年)，并由多個小組審查(Schitine 等人，2015 年) ;Farmer 和 Murai，2017 年;Westergard 和 Rothstein，2020 年)。體內星形膠質細胞基因表達之間的顯著差異使得從整個皮質星形膠質細胞群培養(yǎng)的永生化星形膠質細胞中基因表達水平的顯著差異的發(fā)現(xiàn)不足為奇，因為細胞經歷永生化，這代表了培養(yǎng)細胞群的瓶頸?？绱鷶?shù)的永生化星形膠質細胞系之間的差異可能是由于培養(yǎng)細胞的生長因子信號傳導和改變的細胞外環(huán)境與已發(fā)現(xiàn)其他腦細胞類型會深刻改變星形膠質細胞基因-蛋白質表達的體內條件的差異造成的(Hasel 等人., 2017)。 GLT-1 在培養(yǎng)的星形膠質細胞中的表達被證明取決于神經元和內皮細胞(Martinez-Lozada 和 Robinson，2020)。因此，對于分離的永生化星形膠質細胞培養(yǎng)物，預計 GLT1 表達較低或檢測不到。永生化星形膠質細胞與神經元和腦內皮細胞的共培養(yǎng)是否可以在 hTERT 永生化星形膠質細胞中誘導 GLT-1 表達是未來研究的一個令人興奮的領域。此外，可以檢查 Cx43 存在或缺乏的影響，我們根據實驗結果預測 GLT-1 定位的差異，當 Cx43 和谷氨酸轉運蛋白在非星形膠質細胞系中過度表達時(McCutcheon 等人，2020b) .預計蛋白質表達隨傳代次數(shù)的變化也會發(fā)生在在廣泛使用的轉化細胞系(如 HeLa 細胞和其他高傳代細胞系)中產生顯著基因型和表型差異的眾多機制。我們在圖 6、圖 8 中顯示了數(shù)據，其中細胞使用的通道比我們在本研究中描述的通道更遠。未來研究有和沒有 Cx43 表達的星形膠質細胞對自噬和細胞旁緊密連接促進的影響將需要驗證 Cx43 表達或缺乏表達和其他星形膠質細胞標志物，但這些圖中呈現(xiàn)的結果確實表明這些細胞可以使用到更高的通道數(shù)而不會遇到衰老。 hTERT 衍生的缺乏衰老意味著我們在本報告中開發(fā)和描述的永生化星形膠質細胞可能不適用于衰老和發(fā)育過程中的星形膠質細胞生理學研究。除了內皮細胞表達對星形膠質細胞表達的影響外，圖 1、2 中的發(fā)現(xiàn)表明 AQP4 的表達隨著傳代次數(shù)減少，這意味著 AQP4 表達水平的驗證對于未來使用此處描述的永生化星形膠質細胞系很重要。未來檢查 Cx43 表達和功能結果的影響的研究將需要測試 AQP4 的水平和細胞定位，因為過去的研究顯示了 Cx43 和 AQP4 之間的直接相互作用(Rash 和 Yasumura，1999;Nicchia 等，2005 ; Katoozi 等人，2017 年，2020 年)。先前的研究表明，IL-1β、IL-1α、NFκB 和其他因子在體內和原代星形膠質細胞培養(yǎng)物中對基因表達、形態(tài)和 GJ 連接產生重要變化。永生化星形膠質細胞的反應以及炎癥和細胞損傷條件下 Cx43 表達的影響是 IWCA 和 IKOCA 星形膠質細胞在未來研究中的另一個令人興奮的應用。

上述調查領域中的一些可以從使用此處描述的 WT 和 Cx43null 永生化細胞系中受益。星形膠質細胞的特性及其對生理和病理條件的反應取決于 Cx43 表達的程度，以及使用源自同胞 WT 和 Cx43-null 小鼠的這些星形膠質細胞系應該容易獲得和促進負責任的分子機制和結構域的識別。