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今天推薦的是由美國阿爾伯特愛因斯坦醫(yī)學(xué)院在2021年發(fā)表于Journal of Neuroscience Research(2021 IF4.433, JCR/Q2)的一篇文章，通訊作者是J. Silver 教授和 J.W. Jacobberger教授。

文章摘要

隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟，新生星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外和體內(nèi)促進(jìn)神經(jīng)突生長的能力減弱。此特性與受傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力的發(fā)育喪失有關(guān)。代表未成熟和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系將有助于研究確定這兩個(gè)群體之間的差異。先前關(guān)于雙能神經(jīng)/神經(jīng)膠質(zhì)前體和完全分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞永生化的工作表明，在培養(yǎng)的定時(shí)間隔內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的永生化可能會產(chǎn)生陷入不同成熟狀態(tài)的細(xì)胞系。為了測試一下這一點(diǎn)，在培養(yǎng)的第2、6和17天，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的SV40 T抗原 (Tag) 基因的轉(zhuǎn)移使新生小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞永生化?？寺〖?xì)胞系表達(dá)標(biāo)簽并受到接觸抑制。檢查了隨星形膠質(zhì)細(xì)胞成熟而變化的三種表型，以確定細(xì)胞系代表未成熟和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的保真度。這些是 :( 1) 細(xì)胞形態(tài)，生長模式和大小，(2) 神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAP) 表達(dá)水平，以及 (3) 神經(jīng)突生長促進(jìn)。首先，在形態(tài)和生長模式方面，未成熟和成熟的品系類似于相應(yīng)年齡的凡人1型星形膠質(zhì)細(xì)胞，并保留了細(xì)胞大小的定量差異 (成熟細(xì)胞較大)。其次，GFAP表達(dá)的模式得以保留，未成熟細(xì)胞系的表達(dá)水平低于成熟細(xì)胞系，但與凡人細(xì)胞相比，永生化細(xì)胞系的總體GFAP水平顯著降低。最后，檢查了胚胎雛雞視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在細(xì)胞系單層上的神經(jīng)突生長的促進(jìn)作用。盡管永生化品系的所有神經(jīng)突生長指標(biāo)均明顯大于對照3T3細(xì)胞，但相對于凡人星形膠質(zhì)細(xì)胞，它們的衰減。未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞上更強(qiáng)的生長支持的年齡相關(guān)模式保留用于神經(jīng)突起始，但不保留平均神經(jīng)突長度。因此，SV40標(biāo)簽永生化的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有復(fù)雜的表型，其特征是在形態(tài)，生長模式和細(xì)胞大小方面保留與年齡相關(guān)的差異0 1994 Wiley-Liss，inc.，并且通過某些星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性特征的顯著減弱，但是保留了與年齡相關(guān)的這些相同特征的表達(dá)水平差異，最后，在未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性水平上失去了支持神經(jīng)突延伸的能力。

研究背景

永生化癌基因的表達(dá)會改變細(xì)胞增殖，但保留了明顯程度的細(xì)胞類型特異性表型。終末分化的永生化細(xì)胞保留細(xì)胞特異性特征，即星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)膠質(zhì)絲蛋白，上皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白等。然而，在永生化時(shí)進(jìn)行分化的細(xì)胞似乎被困在其正常分化途徑的分支點(diǎn)或節(jié)點(diǎn)上。在神經(jīng)系統(tǒng)中，保留親本細(xì)胞特征的癌基因永生化細(xì)胞系已經(jīng)從神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)前體、星形膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生 (關(guān)于評論，參見Cepko，1989; Geller等，1991; Lendahl和McKay，1991)。在發(fā)育早期永生的神經(jīng)細(xì)胞具有強(qiáng)大的能力，并在適當(dāng)?shù)拇碳は卤Ａ袅朔只臐摿?。例如，神?jīng)前體細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 (Ryder等人，1990) 和雙勢膠質(zhì)細(xì)胞系可以分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞 (Evrard等人，1988)。

在嚙齒類動(dòng)物中的損傷和移植實(shí)驗(yàn)提供了證據(jù)，表明1型星形膠質(zhì)細(xì)胞在出生后短時(shí)間內(nèi)支持中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 再生，但后來變得不支持 (Smith等，1986; Schreyer和Jones，1987; Smith和Silver，1988)。星形膠質(zhì)細(xì)胞表型的這種變化已經(jīng)在體外通過將神經(jīng)元接種到從不同老年動(dòng)物培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上并測量神經(jīng)突延伸來測定 (Rudge和Silver，1990; Geisert和Stewart，1991; McKeon等，1991; Sagot等，1991)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，未成熟的新生星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)突生長支持也逐漸減少，成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞在大鼠中老化28天 (Fawcett等人，1989; Smith等人，1990) 或在小鼠中老化7天 (Frisa和Jacobberger，1991) 促進(jìn)未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞水平在50-70 '321生長。最近的工作表明，在此期間，幾個(gè)分子的表達(dá)發(fā)生了顯著變化 (Da Cunha等人，1991; Frisa和Jacobberger，1991; Smith等人，1993)。這種變化的動(dòng)力學(xué)是明確定義的，并且看起來是細(xì)胞自主的，即，在體內(nèi)和體外的表達(dá)的時(shí)間依賴性模式看起來是相同的 (Smith等人，1 993)。

由于星形膠質(zhì)細(xì)胞已被SV40 T抗原 (Tag) 表達(dá)永生化，并且由于永生化已被證明在雙分化的特定階段誘捕細(xì)胞，因此我們在不同的出生后時(shí)間將培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞永生化，以詢問Tag是否可以在未成熟和成年階段固定星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，定量評估星形膠質(zhì)細(xì)胞特征在永生化細(xì)胞系中保留的程度將為使用這些細(xì)胞系的研究以及改善永生化載體的努力提供基礎(chǔ)。新生小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在體外老化2、6和17天，用編碼標(biāo)簽的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體永生化，然后克隆。測量細(xì)胞形態(tài)和大小，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 (GFAP) 表達(dá)水平以及神經(jīng)突生長促進(jìn)作用，并將其與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行比較，以評估成熟停滯的程度和星形膠質(zhì)細(xì)胞表型保留的保真度。

研究內(nèi)容

1.SV-40標(biāo)簽永生化CNS細(xì)胞系的表征

來自SV40-6細(xì)胞的含有逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清液用于將野生型SV40大標(biāo)簽基因轉(zhuǎn)移到已在體外培養(yǎng)2、6或17天的新生小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞 (分別稱為PO2D、PO-6D和PO-17D細(xì)胞)。用G418選擇后分離出單個(gè)菌落，然后擴(kuò)增并鑒定。所有細(xì)胞系均表達(dá)標(biāo)簽 (表I)。通過細(xì)胞提取物的免疫印跡或通過在玻璃蓋玻片上生長的細(xì)胞的免疫染色來確定星形膠質(zhì)細(xì)胞系的GFAP表達(dá) (圖1)。26個(gè)品系中只有2個(gè)與單克隆GFAP抗體反應(yīng) (表I)。沒有細(xì)胞系與A2B5抗體或Gal-C抗體反應(yīng)。GFAP的存在和其他標(biāo)記物的不存在證實(shí)了細(xì)胞系的星形膠質(zhì)譜系，并且排除了成纖維細(xì)胞、2型星形膠質(zhì)細(xì)胞、02A祖細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞 (Anderson，1989)。

圖1.星形膠質(zhì)細(xì)胞系的GFAP表達(dá)。永生化的細(xì)胞 (例如該P(yáng)O-17D系) 結(jié)合單克隆抗GFAP，盡管單個(gè)細(xì)胞的GFAP熒光強(qiáng)度不同。

2. 星形膠質(zhì)細(xì)胞系的形態(tài)和生長模式

在形態(tài)上，細(xì)胞系類似于1型星形膠質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)它們亞匯合并生長形成多邊形細(xì)胞的平坦單層時(shí)，它們通常是星狀的 (圖2)。在早期培養(yǎng)時(shí)永生化的細(xì)胞 (圖2A) 比在后期永生化的細(xì)胞 (圖2C) 顯得更小、更少粘附、更細(xì)長，并且保持更少的細(xì)胞間接觸。在融合培養(yǎng)中，未成熟的細(xì)胞系比成熟的細(xì)胞系更緊密地堆積，并且細(xì)胞趨于排列 (圖2B和D)。這些變化與培養(yǎng)過程中初級星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)變化相似。

當(dāng)培養(yǎng)PO-2D和PO-6D品系與PO-171品系相比時(shí)，觀察到明顯的區(qū)別。雖然所有細(xì)胞系都顯示出接觸生長抑制，但PO-17D細(xì)胞系通常在5-7天內(nèi)形成穩(wěn)定的單層，可以無限期地維持而不傳代，很像成熟的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。較年輕的永生化年齡組 (PO-2D和PO-6D) 的接觸抑制程度低于PO17D細(xì)胞系，必須經(jīng)常傳代以維持生存能力。因此，與較老的細(xì)胞系相比，年輕的細(xì)胞系的生長特性發(fā)生了更大的轉(zhuǎn)化。盡管由于成熟的快速動(dòng)力學(xué)，這種差異對于致命的星形膠質(zhì)細(xì)胞很難測量，但與成熟的原發(fā)性星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，原發(fā)性未成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞似乎更具流動(dòng)性，呈紡錘形，并且接觸抑制程度較低。

為了驗(yàn)證細(xì)胞系的視覺大小差異，我們測量了胰蛋白酶-dissoci的直徑相襯光學(xué)下的細(xì)胞。選擇DNA含量為二倍體的細(xì)胞系進(jìn)行比較，因?yàn)榧?xì)胞大小與DNA含量成正比 (Jacobberger，未發(fā)表)。二倍體PO-2D系的直徑為13.25 2 2.06千米 (n = 211)，二倍體PO:17D系的直徑為17.87 2下午4:11 (n = 201) (用于直徑比較，P = 3.3e-59)。部分為四倍體的細(xì)胞系直徑較大 (如預(yù)期的那樣); 但是，當(dāng)估計(jì)非整倍性的比例并用于校正體積差異時(shí)，這些細(xì)胞系在幼株和成熟株之間顯示出相似的直徑差異。培養(yǎng)過程中初級星形膠質(zhì)細(xì)胞的直徑呈線性增加。在2至17天之間，增加42%，這與成熟細(xì)胞系的35% 大直徑相當(dāng)。2天和17天細(xì)胞系的直徑均適度大于相應(yīng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞 (7-12% 差異)。因此，細(xì)胞系比原代星形膠質(zhì)細(xì)胞稍大，但在永生化時(shí)保留了親代星形膠質(zhì)細(xì)胞固有的大小差異。

圖2.星形膠質(zhì)細(xì)胞系的形態(tài)。以低密度和高密度培養(yǎng)PO-2D (A和B) 和PO-17D (C和D) 細(xì)胞系，并用相襯光學(xué)器件觀察。亞融合細(xì)胞 (A和C) 為星狀和融合細(xì)胞 (B和D) 形成類似于原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的扁平單層。與PO-17D細(xì)胞相比，PO-2D細(xì)胞更小，更折射并且具有更少的細(xì)胞間接觸。

3. 細(xì)胞系中GFAP的表達(dá)維持與年齡相關(guān)的差異

基于細(xì)胞系提取物的免疫印跡的觀察表明，最高的GFAP水平出現(xiàn)在培養(yǎng)6天和17天永生化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，這與初級星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP表達(dá)的變化一致 (Chiu和Goldman，1984; Frisa和Jacobberger，1991)。為了證實(shí)這一觀察結(jié)果，使用單克隆GFAP抗體通過流式細(xì)胞術(shù)定量測量了2天和17天星形膠質(zhì)細(xì)胞系中的GFAP表達(dá)。NIH 3T3細(xì)胞在細(xì)胞提取物的免疫印跡或流式細(xì)胞儀上分析時(shí)均未與該抗體反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過流式細(xì)胞術(shù)分析了所有2天和17天的品系，并平均了每個(gè)年齡組的陽性熒光值。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，使用單個(gè)細(xì)胞系作為染色標(biāo)準(zhǔn)，對原代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了測定。17天細(xì)胞系的GFAP比2天細(xì)胞系高11倍 (表11)。老年原代星形膠質(zhì)細(xì)胞抗GFAP的4.5倍反應(yīng)性比未成熟細(xì)胞。因此，雖然細(xì)胞系中的GFAP水平78% 成熟細(xì)胞而91% 未成熟細(xì)胞而降低，但在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到的GFAP表達(dá)的年齡相關(guān)增加得以維持。

4. 神經(jīng)突生長支持隨體外小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡的變化而減少

大鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞顯示出與年齡相關(guān)的神經(jīng)突生長促進(jìn)的衰減，其未成熟特性保持到培養(yǎng)的第10天 (Fawcett等，1989; Smith等，1990)。為了確定小鼠中這種變化的動(dòng)力學(xué)，用雛雞RGC培養(yǎng)在蓋玻片上生長的原代皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞12小時(shí)，并測量來自滑片上每個(gè)RGC的最長至少18千米的神經(jīng)突。Smith等人 (1990) 已經(jīng)表明，雛雞rgc和大鼠前腦神經(jīng)元在大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞上顯示出等效的神經(jīng)突生長。我們使用2個(gè)參數(shù)來評估神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用 :( 1) 每個(gè)蓋玻片的神經(jīng)突長度之和用作神經(jīng)元附著/存活以及神經(jīng)突起始和生長的累積量度，以及 (2) 平均神經(jīng)突長度用于評估總生長支持的一個(gè)方面。

在培養(yǎng)2、6或大于25天的情況下測定新生小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)突生長支持 (表111)。2天星形膠質(zhì)細(xì)胞上的神經(jīng)突長度的總和分別是6天或> 25天的星形膠質(zhì)細(xì)胞的1.6和2倍。平均神經(jīng)突長度遵循相同的進(jìn)展，2天星形膠質(zhì)細(xì)胞的平均長度為1.5，6天和> 25天星形膠質(zhì)細(xì)胞的平均長度為2倍。因此，小鼠的成熟時(shí)間似乎比大鼠快。培養(yǎng)6天后，小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞支持神經(jīng)突生長的能力大大降低。

Fig. 4.(A)注射(i)未處理球體、(ii)TGF-β處理球體、(iii)未處理細(xì)胞和(iv)TGF-β處理細(xì)胞4周的小鼠的代表性全身熒光圖像手術(shù)后。(B)顯示了每組中熒光素酶信號的量化。(C)在原位肝癌小鼠模型中形成的宏觀腫瘤。顯示了注射有(i)TGF-β處理球體和(ii)未處理細(xì)胞的小鼠肝臟的代表性圖像。還顯示了在腹膜(iii，箭頭)和隔膜(iv，圓圈中)中檢測到的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的圖像。(D)顯示了每組(右圖 )每個(gè)肝臟的平均肉眼結(jié)節(jié)數(shù)。(E)

5.永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞系上的神經(jīng)突生長減少，但部分年齡相關(guān)差異明顯

在3個(gè)實(shí)驗(yàn)中評估了雞RGC神經(jīng)突在永生化細(xì)胞系上的生長。為了控制神經(jīng)元制劑的差異，還測定了體外老化34-47天的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。老化的星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)成熟到促進(jìn)生長的平穩(wěn)水平 (Frisa和Jacobberger，199 1)。NIH 3T3細(xì)胞被用作非星形膠質(zhì)細(xì)胞對照。

與原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，永生化細(xì)胞系在神經(jīng)突生長支持下減弱，但在未成熟和成熟細(xì)胞系的比較中可以看出年齡相關(guān)的差異 (表IV)。PO-2D細(xì)胞系的每個(gè)蓋玻片的神經(jīng)突長度總和是PO-17D細(xì)胞系的1.5倍。PO-6D系是中間的。PO-17D線上的神經(jīng)突長度的總和約為老化的初級星形膠質(zhì)細(xì)胞的一半，但比3T3成纖維細(xì)胞大2.25倍。

通過用TuJ 1免疫染色觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞系上的神經(jīng)突生長，TuJ 1特異性結(jié)合小雞視網(wǎng)膜制劑中的rgc。這使我們能夠研究參數(shù)的所有組成部分，即 “神經(jīng)突長度之和”。每個(gè)蓋玻片的rgc總數(shù)是神經(jīng)元附著和存活的量度，在永生化組之間沒有年齡依賴性差異 (表IV)。PO17D細(xì)胞系的RGC存活率14% 低于成熟的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

PO-17D品系顯示與PO-2D品系相比引發(fā)神經(jīng)突的rgc的百分比降低了22.5%，與成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞相比降低了26% (表IV)。然而，成熟品系的神經(jīng)突起始比3T3細(xì)胞高1.6倍。因此，與凡人星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，在細(xì)胞系上的神經(jīng)突起始減弱，但是新生兒和成熟細(xì)胞系之間的年齡相關(guān)差異很明顯。

平均神經(jīng)突長度也在細(xì)胞系上減弱，在這種情況下，未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的與之相關(guān)的差異 (表IV)。細(xì)胞系上的神經(jīng)突長度是老化原代星形膠質(zhì)細(xì)胞長度的80%，但是3T3細(xì)胞長度的1.25-1.3倍。

因此，在我們測試的所有SV40標(biāo)簽永生化小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系中，支持神經(jīng)突生長的能力都減弱了。然而，細(xì)胞系支持神經(jīng)突的生長明顯優(yōu)于非星形膠質(zhì)細(xì)胞系，這表明維持了一定程度的星形膠質(zhì)細(xì)胞特征，并且復(fù)合參數(shù) “神經(jīng)突長度總和” 與年齡相關(guān)的差異，其中包括神經(jīng)元附著和存活，神經(jīng)突起始和神經(jīng)突延伸是顯而易見的。所有年齡組的神經(jīng)元附著存活都是相同的，未成熟細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)突延伸的增強(qiáng)能力并未保留，但是，保留但下調(diào)的功能是神經(jīng)突啟動(dòng)。

“測試的細(xì)胞系數(shù)量或原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物數(shù)量。bGFAP表達(dá)通過流式細(xì)胞術(shù)如材料和方法中所述測量，并以任意熒光單位t SE報(bào)道。'新生星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)2天 (未成熟) 或30天 (成熟)。培養(yǎng)16天的GFAP水平 (n = 2) 與30天的差異沒有。* P = 0.000278用于比較2天和17天的系。** P = 9.77e-05用于比較未成熟和成熟細(xì)胞。

孵育12小時(shí)后，測量了接種在星形膠質(zhì)細(xì)胞單層上的胚胎雛雞視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)突生長。將細(xì)胞固定在甲醛中，并用A2B5免疫染色。測量了每個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中至少下午18點(diǎn)的最長神經(jīng)突。每個(gè)蓋玻片的這些長度和平均長度的總和被報(bào)告為SE。“測試的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的數(shù)量。* P = 0.0387用于比較2天和> 25天的星形膠質(zhì)細(xì)胞。** P = 0.0318用于比較2天和> 25天的星形膠質(zhì)細(xì)胞。P = 0.0129用于比較2天和> 25天的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

培養(yǎng)12小時(shí)后，測量了接種在星形膠質(zhì)細(xì)胞單層上的胚胎雛雞視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 (rgc) 的神經(jīng)突生長。將細(xì)胞固定在甲醇中并用tuj1免疫染色。同時(shí)測定成熟的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞作為對照。測量每個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的最長至少18 )* m的神經(jīng)突。報(bào)告了每個(gè)蓋玻片的這些長度之和，每個(gè)蓋玻片的rgc總數(shù)，帶有神經(jīng)突的rgc百分比以及平均神經(jīng)突長度k SE?！皽y試的細(xì)胞系數(shù)量或3T3或星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物數(shù)量。* P = 0.0122用于2天和17天細(xì)胞系的比較。P = 0.00531用于比較17天細(xì)胞系和3T3細(xì)胞。P = 0.000219用于比較17天細(xì)胞系和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞。** P = 0.069用于17天細(xì)胞系和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的比較。*** P = 0.0011用于2天和17天細(xì)胞系的比較。P = 0.0015用于比較17天細(xì)胞系和3T3細(xì)胞。P = 0.00018用于比較17天細(xì)胞系和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞。**** P = 0.00162用于比較17天細(xì)胞系和3T3細(xì)胞。P = 9.71e-05，用于比較17天細(xì)胞系和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞。

圖3.永生化細(xì)胞系，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞和3T3細(xì)胞的生長促進(jìn)。給出了永生化細(xì)胞線 (虛線) 上每個(gè)蓋玻片的神經(jīng)突長度 (填充符號) 和平均神經(jīng)突長度 (開放符號) 的總和相對于初級星形膠質(zhì)細(xì)胞 (實(shí)線) 和3T3細(xì)胞 (不均勻虛線) 的相同值。該數(shù)據(jù)取自表111和IV，其中細(xì)胞系和3T3細(xì)胞的值標(biāo)準(zhǔn)化為成熟的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。

結(jié)論與討論

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的SV40 T抗原基因的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了不朽的小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞系，能夠在培養(yǎng)物中形成穩(wěn)定的單層。這些品系保留了1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化表型，通過形態(tài)學(xué)，GFAP表達(dá)以及支持神經(jīng)突生長的能力比成纖維細(xì)胞對照細(xì)胞 (NIH 3T3) 更高。此外，當(dāng)將培養(yǎng)早期永生的未成熟新生星形膠質(zhì)細(xì)胞與培養(yǎng)數(shù)周后永生的衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，與年齡相關(guān)的表型的總體模式保留了細(xì)胞形態(tài)，大小，生長模式，GFAP表達(dá)和神經(jīng)突起始。然而，與相應(yīng)年齡的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，GFAP表達(dá)和神經(jīng)突生長支持減弱。

在初級星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，一些形態(tài)變化很明顯。未成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞比成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞更紡錘形，粘附在培養(yǎng)皿上的效果較差，細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸更少，并且生長到更高的密度。未成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞30% 小于成體細(xì)胞。這些與年齡相關(guān)的關(guān)系保留在未成熟和成熟階段永生的星形膠質(zhì)細(xì)胞中。

GFAP表達(dá)隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡的增長而增加 (Chiu和Goldman，1984; Frisa和Jacobberger，199 1)，并且預(yù)期在成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系中比在未成熟細(xì)胞的細(xì)胞系中更高。從免疫印跡中可以明顯看出，6天和17天系的GFAP水平通常高于2天系。流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，2天細(xì)胞系的GFAP含量少于17天細(xì)胞系，并且兩組細(xì)胞系的表達(dá)均少于母體星形膠質(zhì)細(xì)胞群體。因此，GFAP表達(dá)模式與永生化星形膠質(zhì)細(xì)胞系中年齡相關(guān)差異的保留一致，但與不表達(dá)Tag的星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，表達(dá)明顯受到抑制。

總神經(jīng)突生長支持，或每個(gè)蓋玻片的神經(jīng)突長度之和，是一種復(fù)合統(tǒng)計(jì)量，涵蓋了星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用的許多方面。它反映了神經(jīng)元附著，存活，神經(jīng)突起始和神經(jīng)突延伸的差異。增加這些組件中的任何一個(gè)都會增加總長度統(tǒng)計(jì)。對于神經(jīng)突長度的總和，與每個(gè)年齡的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，細(xì)胞系中的表型有相等的減少 (圖3)。當(dāng)解剖該表型的成分時(shí)，很明顯，主要的成熟特異性作用是神經(jīng)突起始的年齡依賴性降低。這表明Tag表達(dá)減少了總長度參數(shù)的起始和可能的其他組成部分，從而將與年齡相關(guān)的差異保留在減弱的水平。

神經(jīng)突延伸 (平均神經(jīng)突長度) 在PO-2D系中被強(qiáng)烈下調(diào)，但在PO-6D系和PO-17D系中被弱下調(diào) (圖3)。所有永生化年齡組均以接近成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞的水平支持神經(jīng)突延伸。因此，SV40標(biāo)簽的表達(dá)或永生化抑制了新生兒特異性神經(jīng)突的延伸支持，或者沒有阻止正常成熟依賴性的表型降低。在任何一種情況下，由于細(xì)胞系比3T3細(xì)胞支持更多的神經(jīng)突延伸，因此這些細(xì)胞系似乎保留了一定程度的星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性神經(jīng)突延伸支持。這可能是由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的成年階段特異性分子的表達(dá)所致。

關(guān)于大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系的最新結(jié)果 (Goodman等人，1993) 與我們對小鼠的結(jié)果相似，因?yàn)樾律统赡晷切文z質(zhì)細(xì)胞之間的神經(jīng)突起始差異得以保留。然而，與年齡相關(guān)的在大鼠系中，平均神經(jīng)突長度的差異保持在減弱的水平，但在小鼠系中卻消失了。成熟的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系是由成年大鼠產(chǎn)生的，而不是由在體外短期內(nèi)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的。隨著動(dòng)物年齡的增長，神經(jīng)突生長支持可能會逐漸減少。另一種解釋是小鼠和大鼠對T抗原的反應(yīng)不同 (Patschinsky et a]，1992)。

許多證據(jù)表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞上的神經(jīng)突生長是涉及許多分子物種的復(fù)雜過程 (參見Reichardt等人，1989; Bixby和Harris，1991; Walsh和Doherty，1991綜述)。我們在神經(jīng)突生長支持中觀察到的影響可能是由于Tag表達(dá)引起的，并且Tag可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞表型這一方面的多個(gè)成分相互作用不同。一個(gè)簡單的模型是標(biāo)簽下調(diào)對神經(jīng)突生長重要的新生兒特異性分子。對該模型的支持來自醌-Jenab等人 (1990) 的工作。他們報(bào)道了從用溫度敏感標(biāo)簽永生化的新生兒培養(yǎng)隔離出小鼠下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞系。在允許的溫度下，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子 (NCAM) 的表達(dá)水平較低。在轉(zhuǎn)移到高燕鷗之后因此，NCAM的表達(dá)明顯增加。這表明一個(gè)分子在新生兒星形膠質(zhì)細(xì)胞上高水平表達(dá)，但不是成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞 (Frisa和Jacobberger，1991; Smith等人，1993)，并與神經(jīng)突生長有關(guān) (Neugebauer等人，1988; Doherty等人，1990a，b，1991; Smith等人，1990) 被標(biāo)簽表達(dá)下調(diào)，但當(dāng)標(biāo)簽不活動(dòng)時(shí)重新表達(dá)。我們已經(jīng)測量了多克隆標(biāo)簽永生化新生星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞系的NCAM水平 (未發(fā)表)。這些品系在培養(yǎng)2天時(shí)表達(dá)NCAM的水平低于新生兒原代星形膠質(zhì)細(xì)胞水平的20%。NCAM下調(diào)可能是新生兒神經(jīng)突延伸表型喪失的因素之一。HNK-1，隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞年齡的增加而減少的細(xì)胞表面碳水化合物表位 (Frisa和Jacobberger，1991; Smith等，1993) 在永生化細(xì)胞系上也較低。由于該表位被許多蛋白質(zhì)共享，因此這表明Tag可能在共同點(diǎn)起作用以影響這些分子的整體損失。我們的簡單模型表明，成年星形膠質(zhì)細(xì)胞上的神經(jīng)突生長可能取決于不受Tag影響的分子。例如，我們已經(jīng)表明，成熟時(shí)的N-鈣粘蛋白表達(dá)高于新生星形膠質(zhì)細(xì)胞 (Frisa和Jacobberger，1991)。該分子的表達(dá)在多克隆細(xì)胞系中似乎未下調(diào) (未發(fā)表)。

為了產(chǎn)生對研究具有最大作用的永生化細(xì)胞系，有必要開發(fā)永生化載體，以產(chǎn)生表現(xiàn)出最小的表型改變的星形膠質(zhì)細(xì)胞系。由于我們已經(jīng)在定量方面定義了星形膠質(zhì)細(xì)胞表型，因此這項(xiàng)工作為SV40標(biāo)簽的突變分析提供了基礎(chǔ)，以測試一下我們標(biāo)簽誘導(dǎo)的下調(diào)的簡單模型的有效性，如果成立，則確定負(fù)責(zé)表型衰減的域。與Tag相互作用的許多細(xì)胞分子是已知的，并且缺乏這些相互作用的Tag突變體很容易獲得。因此，如果Tag特異性下調(diào)新生兒神經(jīng)突生長表型，我們可能會發(fā)現(xiàn)一些調(diào)節(jié)分子，從而調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)突生長支持表型的途徑。

此外，我們期望這些細(xì)胞系是有用的 :( 1) 用于表達(dá)被認(rèn)為在神經(jīng)突生長支持中重要的分子，以努力重建神經(jīng)突生長表型;(2) 在沒有成熟的情況下對星形膠質(zhì)細(xì)胞周期控制的調(diào)節(jié)進(jìn)行初步研究 (因?yàn)樗鼈內(nèi)匀粚ιL因子有反應(yīng)); (3) 為基因轉(zhuǎn)移研究提供良好的非致瘤性克隆細(xì)胞，以檢查特定癌基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展中的作用。總之，我們在逐漸進(jìn)行55消耗臭氧層培養(yǎng)后，用SV40標(biāo)簽將新生小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞永生化，并評估了所得克隆細(xì)胞系的成熟程度。這些細(xì)胞系顯示出高度的接觸抑制并被生長調(diào)節(jié)。細(xì)胞形態(tài)，生長模式，細(xì)胞大小，GFAP表達(dá)以及星形膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)突生長的能力被用來定義從未成熟狀態(tài)到成熟狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變對應(yīng)于失去神經(jīng)再生潛能的體內(nèi)時(shí)期。在培養(yǎng)的第2天創(chuàng)建的新生兒系似乎在未成熟狀態(tài)下被部分阻止，即，它們顯示出比成熟狀態(tài)更多的暗示未成熟狀態(tài)的方面。在培養(yǎng)的第6天和第17天產(chǎn)生的細(xì)胞系在表型上與成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞相似。在所有年齡組中，與凡人星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，表型的某些方面均下調(diào)。

總的來說，證據(jù)表明 :( 1) 永生化確實(shí)使星形膠質(zhì)細(xì)胞停滯在特定的成熟階段; (2) T抗原的表達(dá)或永生化導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性表型的廣泛下調(diào)或減弱;(3) 增加新生兒特異性神經(jīng)突延伸的神經(jīng)突生長支持的成分似乎通過相同的機(jī)制被完全廢除，或者因?yàn)楸硇偷倪@一方面發(fā)展到成熟而與其他性狀無關(guān)。