體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞一樣，不僅需要營養(yǎng)物質(zhì)，更需要一個穩(wěn)定的生活環(huán)境，如溫度、CO2濃度、濕度等，二氧化碳培養(yǎng)箱則是最佳選擇。二氧化碳培養(yǎng)箱是在普通培養(yǎng)的基礎(chǔ)上通過在培養(yǎng)箱箱體內(nèi)模擬形成一個類似細(xì)胞在生物體內(nèi)的生長環(huán)境，如合適的溫度(37°C) 、恒定的CO2水平(常用5%)、穩(wěn)定的酸堿度(pH值: 7.2-7.4) 、較高的相對飽和濕度(常用95%)，來對細(xì)胞或組織進(jìn)行體外培養(yǎng)的一種裝置。其用途甚廣，主要用來培養(yǎng)細(xì)胞、組織和某些特殊微生物，為它們提供一個良好的體外環(huán)境，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)實驗、微生物學(xué)實驗、組織學(xué)實驗以及分子生物學(xué)實驗。因此，CO2 培養(yǎng)箱的消毒和維護(hù)尤為重要。

細(xì)胞培養(yǎng)箱消毒使用和維護(hù)介紹

1.二氧化碳培養(yǎng)箱的污染

凡混入CO2培養(yǎng)箱(細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境)中，對細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。細(xì)胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長時，輕者細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞分化變形，較重的細(xì)胞增殖停止，從瓶壁脫落，甚至死亡。不同的污染物對細(xì)胞的影響也有差別，有的影響是長期、緩慢和潛在的，而有的則能在很短的時間內(nèi)抑制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺害細(xì)胞。根據(jù)污染源不同主要可以分為：生物性污染、化學(xué)性污染、物理性污染和氣溶膠污染。

1.1生物性污染

這是最常見也是危害最大的污染。如細(xì)菌、病毒、真菌，支原體等。這些污染源有可能是人為帶入，或是細(xì)胞在放入培養(yǎng)箱前已經(jīng)受污染，再或者是箱體本身沒有消毒干凈。體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而培養(yǎng)基中所加抗生素的抗微生物污染的能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無法挽救的。

1.2化學(xué)性污染

培養(yǎng)箱中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞污染。如細(xì)胞培養(yǎng)容器清洗過程中殘留的洗滌劑、加濕器中未純化的水、人為帶入的液體或氣體都可能成為化學(xué)性污染的來源。不同化學(xué)物質(zhì)對細(xì)胞污染是不一樣的，有的可能促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長，有的甚至殺死細(xì)胞。

1.3物理性污染

培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染，其主要是在代謝水平或分子水平上，影響細(xì)胞正常的生理過程。

1.4氣溶膠污染

氣溶膠是液體或固體微粒均勻地懸浮在氣體介質(zhì)中的分散體系，當(dāng)微粒是微生物時，就是微生物氣溶膠，如果這種微生物是病原性的，就是病原微生物氣溶膠。細(xì)菌、病毒等病原體通過氣溶膠可在人與人、人與環(huán)境之間傳播。微生物氣溶膠可分為兩大類：一類是飛沫核氣溶膠，另一類是粉塵氣溶膠。醫(yī)學(xué)實驗室內(nèi)許多操作都可以產(chǎn)生氣溶膠，并且大多可能是病原微生物形成的感染性氣溶膠，由于其氣溶膠分子小，漂浮在空氣中、粘附于人身上，易在空氣中擴(kuò)散而污染實驗室的空氣。

2.CO2培養(yǎng)箱污染防控措施

2.1.CO2培養(yǎng)箱的選擇

二氧化碳培養(yǎng)箱的制造商們設(shè)計了多種不同的裝置去減少和防止污染的發(fā)生，其主要是防污染設(shè)計和消毒滅菌系統(tǒng)的改進(jìn)，以達(dá)到消毒滅菌的目的。如帶有紫外消毒功能的CO2培養(yǎng)箱、帶HEPA過濾器的CO2培養(yǎng)箱，以及帶高溫消毒的CO2培養(yǎng)箱等，后者又分為高溫干熱和高溫濕熱兩類。這些裝置的滅菌能力各有千秋，紫外燈消毒范圍有限，距離燈越遠(yuǎn)，消毒能力越差。HEPA 過濾器的過濾膜孔徑有限，無法去除病毒和一些微小細(xì)菌，并且容易損耗，也有其局限性。相比而言，高溫消毒則是比較有效的方法。而高溫干熱和高溫濕熱也有所不同，由于蒸汽潛熱大、穿透力強，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，因此高溫濕熱的滅菌效率比干熱滅菌法高。

2.2.提高素質(zhì)

人為因素和態(tài)度可以對環(huán)境、人和物起到一個正面或負(fù)面的影響。以安全為目的，實驗室內(nèi)的工作人員應(yīng)明白自身的態(tài)度和人為因素對實驗環(huán)境的重要性。因此，對實齡室工作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，特別是進(jìn)實驗室前的培訓(xùn)。并且定期進(jìn)行考核檢查是十分必要的。

2.3重視管理

細(xì)胞室內(nèi)的培養(yǎng) 箱應(yīng)由專人負(fù)責(zé)管理，定期對系統(tǒng)進(jìn)行校正，至少每年一次。各項數(shù)值一旦固定后，不要隨意調(diào)節(jié)，以免影響箱內(nèi)溫度、濕度、CO2濃度的波動，降低機器的靈敏度，同時還會影響培養(yǎng)箱內(nèi)的細(xì)胞生產(chǎn)狀態(tài)。使用前，對培養(yǎng)箱的各項指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)校正，并且對箱體和內(nèi)部進(jìn)行消毒處理，等各項數(shù)值穩(wěn)定一段時間后方可使用。一旦出現(xiàn)緊急問題，應(yīng)及時上報，應(yīng)由專業(yè)的人員進(jìn)行操作，馬上采取應(yīng)對措施，以免造成不必要的損失。

2.4規(guī)范操作

培養(yǎng)箱的使用雖然很簡單，但同樣需要規(guī)范操作。進(jìn)細(xì)胞室必須穿著實驗服(白大褂)，換上拖鞋或者穿一次性的鞋套。實驗操作時必須帶一次性手套， 特別是打開培養(yǎng)箱前，必須先用75%的酒精噴壺噴洗雙手再開培養(yǎng)箱，再取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。顯微鏡下查看細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板后，再放回培養(yǎng)箱時，同樣也要噴酒精消毒。培養(yǎng)箱的兩個門開關(guān)取(放)物要迅速，不可長時間開著，否則會影響CO2的濃度、溫度和濕度，以及造成污染。尤其是不要忘了關(guān)好里層的玻璃門。切記開時不要對著培養(yǎng)箱說活，大口呼吸甚至是打噴嚏。

2.5加強防護(hù)

如果實驗人員生病而攜帶病菌，應(yīng)帶上口罩再進(jìn)細(xì)胞室，病情嚴(yán)重的則不宜進(jìn)行實驗。女性同志實驗時頭發(fā)應(yīng)梳起，防止皮屑污染及連帶事件的發(fā)生。如果實驗室條件允許，可以每人佩戴實驗帽、手套和口罩，以防污染培養(yǎng)箱及對實驗人員的自身的防護(hù)。

2.6注重保養(yǎng)

二氧化碳培養(yǎng)箱置于細(xì)胞室中，室內(nèi)需保持干燥，環(huán)境溫度不能超過30℃ (建議: 18℃ -30℃)。培養(yǎng)箱放置在遠(yuǎn)離門窗、供暖設(shè)備和空調(diào)導(dǎo)管的地方，不能被陽光直接照射。培養(yǎng)箱的放置臺面必須水平避震且非易燃材質(zhì)，不能靠在墻壁或類似的建筑物上，其后部接電處和墻壁至少保留30cm的空間。一旦放好不宜再移動。

2.7校正處理

二氧化碳培養(yǎng)箱在放好后，再對箱體和內(nèi)部進(jìn)行消毒處理，并且對各項指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)校正，等各項數(shù)值穩(wěn)定一段時間后方可使用。因CO2氣體對于健康是有害的，因此細(xì)胞室需安裝足夠的通風(fēng)裝置。空氣中的粉塵氣溶膠易造成培養(yǎng)箱的污染，需要一個流通的空氣環(huán)境。將培養(yǎng)箱的管理任務(wù)分派給有經(jīng)驗的檢查人員是十分重要的。如長期不使用二氧化碳時，應(yīng)將CO2開關(guān)關(guān)閉，防止CO2調(diào)節(jié)器失靈。

3.清潔、消毒、滅菌處理

3.1清潔

清潔是指去除灰塵、污垢和有機污漬。清潔方法包括刷、吸、干擦、洗滌或用浸泡肥皂水或清潔劑的濕布拖擦。粉塵、污物以及有機物是微生物的棲身之所，并可能影響除污染劑(抗菌劑、化學(xué)殺菌劑以及消毒劑)的作用。必須先經(jīng)過清潔才能實現(xiàn)消毒和滅菌的目的，許多殺菌劑只對經(jīng)過清潔過的物品才具有殺菌活性。清潔時必須使用與以后使用的消毒劑或殺菌劑化學(xué)性質(zhì)上相容的試劑進(jìn)行清潔、消毒。

3.1.1清潔箱體表面

先拂去表面的灰塵，再用濕的海綿或軟布清洗，再用軟布擦干。如果有污物則用低濃度的清潔劑清洗，然后擦干。

3.1.2清洗箱體內(nèi)部

選擇合適的消毒劑。所有的物件和表面必須徹底清洗，然后用無菌水沖洗，再擦干或晾干。

3.1.3清洗玻璃門

清洗箱內(nèi)的玻璃門時使用的清潔劑和清洗培養(yǎng)箱內(nèi)部時使用的相同。然后用蒸餾水漂洗，從而清除殘留的清潔劑，最后用軟布把門擦干。

3.2消毒和滅菌

消毒是指殺死微生物的物理或化學(xué)手段，但不一定殺死其孢子。滅菌是指殺死所有微生物，當(dāng)培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞受到污染時則需要采取滅菌措施。一般， 在培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞沒有污染的情況下平均1-3個月徹底消毒一次。最常用的3種消毒滅菌的方式是：液體消毒劑、紫外和加熱。

3.2.1液體消毒劑

選擇對培養(yǎng)箱無腐蝕性的液體消毒劑，并且液體消毒劑的消毒效果好壞和很多因素有關(guān)。比如：場所的溫度、接觸時間、pH、穿透能力、有機物的反應(yīng)。這些因素中的一些很小的變化可能會造成去污劑的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情況下，當(dāng)最終要求必須無菌時，液體去污劑也不是完全可信賴的去污方法。

3.2.2紫外消毒

一般先用蒸餾水清洗干凈后，再用紫外燈照射(帶紫外燈的培養(yǎng)箱)一天或者用手提式的紫外燈照射。

3.2.3加熱

濕熱和干熱被認(rèn)為是殺菌最有效的方法。在一般環(huán)境下，高壓滅菌器加熱到121℃快速產(chǎn)生蒸汽是最方便的方法。干熱160℃-170℃，2-4小時在不具有滲透性、非有機體的物質(zhì)(如玻璃)是可行的凈化方法，但是甚至在有機體或非有機體的淺層也不能被絕緣。

除了以上幾種方法外，還可以采用聯(lián)合殺菌的方法，幾種消毒滅菌的方法同時使用來達(dá)到徹底清潔的效果。

3.3.細(xì)胞室內(nèi)空氣的消毒

3.3.1聯(lián)合消毒法

可以聯(lián)合使用液體和氣體消毒劑來清除實驗室空間、用具和設(shè)備的污染。清除表面污染時可以使用次氯酸鈉溶液：濃度0.1%溶液用于普通的環(huán)境衛(wèi)生設(shè)備，而當(dāng)處理高危環(huán)境時，建議使用高濃度(0.5%)的溶液。在清除環(huán)境污染時，含有3%過氧化氫的溶液也可以作為漂白劑的代用品。

3.3.2熏蒸法

通過加熱多聚甲醛或煮沸福爾馬林所產(chǎn)生的甲醛蒸汽熏蒸來清除房間和儀器的污染。這是一項需要由專門培訓(xùn)的專業(yè)人員來進(jìn)行的、非常危險的操作。產(chǎn)生甲醛蒸汽前，房間的所有開口(如門窗等)都應(yīng)用密封帶或類似物加以密封。熏蒸應(yīng)當(dāng)在室溫不低于21℃且相對濕度高于70%的條件下進(jìn)行。熏蒸法消毒時，氣體需要與物體表面接觸至少8小時，而熏蒸后，該區(qū)域必領(lǐng)徹底通風(fēng)后才能允許人員進(jìn)入。

3.4消毒注意事項

3.4.1不要使用強堿和強腐蝕性的試劑以及含高含量次氯酸鈉的漂白劑和消毒劑，雖然不銹鋼有耐腐蝕性，但不是不受腐蝕。

3.4.2避免在CO2傳感器上噴酒清洗劑，清洗之前要使傳感器充分冷卻。一般清洗用的水是蒸餾水或去離子水，不能用自來水。

3.4.3揮發(fā)性的甲醛有毒，易燃、易爆。如果在培養(yǎng)箱內(nèi)殘留甲醛的話，會影響細(xì)胞正常生長，甚至使細(xì)胞死亡。

參考文獻(xiàn)

細(xì)胞室二氧化碳培養(yǎng)箱的消毒使用和維護(hù)，通訊作者：鄧伊王志強

[1]蘇麗東.不同消毒方法對培養(yǎng)箱恒濕罩的消毒效果的比較[J]護(hù)理實踐與研究,2011,8(20):93.

[2]劉淑艷，辛德梅,王敏，等.不同消毒劑對早產(chǎn)兒培養(yǎng)箱消毒效果分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011 ,38(11):2029- 2030.

[3]張曉紅，劉堅，楊志敏,等.不同濃度含氯消毒劑對嬰兒培養(yǎng)箱消毒效果的比較[J]中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011 ,21(19); 4083- 4084.