今天推薦的文章是由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)、組織學(xué)與發(fā)育生物學(xué)系，深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，中國(guó)深圳市寶安市人民醫(yī)院產(chǎn)科以及中國(guó)深圳福田市婦幼保健院產(chǎn)科發(fā)表在BIOTECHNIQUES2019年IF: C1.659，JCRQ3)，通訊作者是Zhong Huang 和Jianyong Xu教授

文章摘要

間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 已被深入研究并廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和免疫調(diào)節(jié)。 然而，它們的功效在衰老或疾病過程中會(huì)下降。 因此，具有特定基因過表達(dá)或抑制的基因組編輯的 MSC 在其治療應(yīng)用方面具有很大的前景。 在這里，我們優(yōu)化了直接 PCR 方法，用于快速識(shí)別只有 10 個(gè)細(xì)胞的基因組編輯的 MSC，從而減少了擴(kuò)展 MSC 單克隆所需的時(shí)間和勞動(dòng)力。結(jié)合我們之前針對(duì) Cas9 優(yōu)化的引導(dǎo) RNA 結(jié)構(gòu)和質(zhì)粒構(gòu)建策略，我們成功鑒定了 AAVS1 基因座中過表達(dá) IL-10 的 MSC 單克隆。

研究背景

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有多能(軟骨細(xì)胞成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)和自我更新能力它們已被提出作為干細(xì)胞治療的有效和安全的細(xì)胞來源，免疫原性低且沒有重大倫理問題。在衰老或疾病過程中療效下降。因此，具有特定基因過表達(dá)或抑制的基因組編輯的MSCs在治療應(yīng)用方面具有很大的前景。

通常，在基因組編輯后，需要擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞單克隆以達(dá)到足夠的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行 DNA 提取，這既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。因此，開發(fā)和優(yōu)化直接細(xì)胞裂解和 PCR 方法對(duì)于快速具有低細(xì)胞數(shù)的基因組編輯的 MSC 單克隆的表征。事實(shí)上，直接細(xì)胞裂解和 PCR 方法已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，用于快速 DNA 表征。然而，其在表征基因組編輯的 MSCs 中的應(yīng)用尚未得到證實(shí)。

在目前的研究中，我們首先比較了直接細(xì)胞裂解和 PCR 分析的不同方法。我們發(fā)現(xiàn)含有 Tween 20 和蛋白酶 K(PK) 的裂解緩沖液是從僅 10 個(gè)細(xì)胞中釋放 DNA 的最有效方法，其靈敏度足以用于 PCR 檢測(cè)此前，我們已經(jīng)確定了一種優(yōu)化的具有更高基因組編輯效率的引導(dǎo) RNA 結(jié)構(gòu)，并建立了一種更有效的 Cas9-gRNA 質(zhì)粒構(gòu)建策略，然后我們將這些技術(shù)結(jié)合在一起，將免疫抑制基因 iL-10 插入到 AAVS1 位點(diǎn)安全人類基因組的安全港。

方法與技術(shù)

材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)

從臍帶中分離出人MSC。 出生后10分鐘收集臍帶并獲得知情同意。臍帶儲(chǔ)存在DMEM/高糖(Gibco.USA)中，含抗生素(500units/ml青霉素和500ug/ml鏈霉素)冰上并送至實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞分離應(yīng)在 8 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行。 將臍帶切碎成 1-3 mm3 的碎片，并在 1 mg/ml 膠原酶 B(STEMCELL Technologies，在 DMEM/高葡萄糖中稀釋)中在 37°C 下孵育 12 小時(shí)。然后將分離的單細(xì)胞在 DMEM/高葡萄糖(Gibco，USA)加 5% 血小板溶酶酸鹽(Sigma)2U/ml 肝素和抗生素(100 units/ml 青霉素和 100ug/ml 鏈霉素)中擴(kuò)增。用 0.05% 胰蛋白酶 EDTA(Thermo Scientific)傳代人體 MSC。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表征(CD90 FITC mouse anti-human BD Biosciences 555595 CD73-FITCmouse anti-human BD Biosciences 561254 CD105-FITC mouse anti-human BD Biosciences561443: HLADR-PE mouse anti-human BD Biosciences 562304; CD45-PE mouse anti-human BD Biosciences 555483:CD34-PEmouse anti-humanBD Biosciences 550761 CD19-PE mouse anti-human BD Biosciences555413:CD11b-PEmouse anti-human BD Biosciences555388使用Stem Prochondro genesis分化試劑盒(Gibco) StemPro進(jìn)行分化脂肪生成分化試劑盒 (Gibco) 和 StemPro 成骨分化試劑盒 (Gibco)。

直接細(xì)胞裂解和PCR 比較了12種不同的直接細(xì)胞裂解方法。程序如下

(1) 直接裂解法：將細(xì)胞懸浮于15 ul PBS中，95℃孵育15 min，12.000rpm離心1 min后，上清液直接用于PCR。

(1l) PK 法：該方法如前所述進(jìn)行，并進(jìn)行了修改。簡(jiǎn)單地將細(xì)胞懸浮在 15 ul 裂解緩沖液(10 mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA , pH8.0，0.2M NaCl 和 1mg/ml 蛋白酶 K)中，然后加入 55 ℃ 60 分鐘，然后 95 分鐘 15 分鐘，上清液在 12.000 rpm 離心 1 分鐘后直接用于 PCR

(111) PK-T20(蛋白酶 K-Tween 20 法：該方法如前所述進(jìn)行，并進(jìn)行了修改。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞懸浮在 15ul lysis 緩沖液(10 mM Tris-HCl pH8.0,，2mM EDTA pH 8.0，2% Tween 20 和 1 mq/ml 蛋白酶 K)，然后 55*C 60 分鐘，然后 95*C 15 分鐘：上清液在 12,000 rpm 離心 1 分鐘后直接用于 PCR。

(IV)PK-SDS-1(Proteinase K-SDS1%) 法：此方法如前所述進(jìn)行，但有修改6] 簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞懸浮在 15 ul 裂解緩沖液中(1%SDS+1mg/mPK5% Tween 20.5%NP -40.0.1%BSA 和 1%PVP40)，然后是 55C 60 分鐘，然后是 95C15 分鐘;上清液以 12000 rpm 離心 1 min 后直接用于 PCR。

(V) PK-SDS-0.5(ProteinaseK-SDS 0.5%)法：細(xì)胞懸浮于15u裂解緩沖液(0.5%SDS+1mg/mlPK.5% Tween20.5%NP-40.0.1%BSA和1%PVP40)，然后55C 60分鐘，然后95C 15分鐘，上清液在12.000rpm離心1分鐘后直接用于PCR

(VI)PK-SDS-01(蛋白酶K-SDS 0.1%)法：將細(xì)胞懸浮于15μlsis緩沖液(0.1%SDS+1ma/mlPK5%Tween20.5%NP-40.0.1%BSA和1% PVP 40)中，55°C 60 min，95°C 15 min，取上清液12000rpm離心1min后直接用于PCR

(VI) NaOH 法：該方法如前所述進(jìn)行，但經(jīng)過改良 10.151 將細(xì)胞懸浮在 10 u50mM NaOH 中，然后 95C 10 min，用 5ul(1/10 volume)1M Tris-HCl pH 8.0 中和;上清液在 12.000rpm 離心 1min 后直接用于 PCR

(VIII) KOH 法：該方法如前所述進(jìn)行修改 簡(jiǎn)單地將細(xì)胞懸浮在 10 ullysis 緩沖液(200mM KOH，50mMDTT)中，然后在 65C 下孵育 10 分鐘，并通過 5 中和緩沖液中和(300mM KCl，900mM Tris-HC DH 8.3200 mM HCl：上清液用于 PCR 直接在 12 分鐘后離心 1 分鐘。

(IX)NL(N-Lauroysarcosinesalt)法：該方法按照之前的描述進(jìn)行，并進(jìn)行了修改[13]簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞懸浮在 15 ul 裂解緩沖液(3uH.O 3u/250na/ulpolvadenvlic acid3w10mM EDTA3w/250mMDTT 3u)中0.5%N-月桂酰肌氨酸鹽溶液)，然后在 95℃ 孵育 10 分鐘，上清液在 12000 轉(zhuǎn)/分離心 1 分鐘后直接用于 PCR

(X)NaOH-T20(NaOH-Tween20)法：細(xì)胞懸浮10溶解(100mM NaOH和2%Tween20)：95℃孵育10分鐘，用5個(gè)中和緩沖液中和(100mM Tris-HCL2mM EDTA：12.000離心后上清直接用于PCR rpm 1 分鐘

(XI)PK-Igepal-T20(Proteinase K-gepal Tween 20) 法：該方法如前所述進(jìn)行，經(jīng)過修改 8l。簡(jiǎn)單地將細(xì)胞懸浮在 15 ul lvsis 緩沖液(10 mM Tris-HC pH8.0，2 mM EDTA pH 8.0.1% Tween 20.1% lqepal 和 1 mg/ml 蛋白酶 K)，然后 55°C 60 分鐘，然后 95°C 15 分鐘，上清液在 12.000rom 離心 1 分鐘后直接用于 PCR

(XIl)Amp(Extract-N-AmDBlood PCR Kits)法：細(xì)胞按照制造商的說明進(jìn)行裂解(Sigma)

PCR在含有2x PCR Master Mix(Thermo Scientific) 10 uM正向和反向引物的25 u的totayolume中進(jìn)行，以及從上述方法獲得的12 ulcell裂解液。引物用于從 AASV1 位點(diǎn)擴(kuò)增一個(gè) 1106 bp 片段。進(jìn)行正向 5-CCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCG-3 和反向：5CTAGGACCACCATTCTCA CAAAGG-3,40次PCR 循環(huán)

基因鑒定

供體質(zhì)粒購(gòu)自 SBI System Biosciences)。按照制造商的說明，將人 IL-10 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并克隆到供體質(zhì)粒中，如前所述將 gRNA 靶序列 (5-GGGGC CACTAGGACAGGAT-3) 克隆到我們的 Cas9-gRNA 系統(tǒng)中, 通過 PureYield? Plasmid Maxiprep System (Promega) 純化質(zhì)粒。 1 μg 供體質(zhì)粒，加上 500 ng gRNA 質(zhì)粒和 500 ng hCas9 質(zhì)粒與 2 μl Lipofactamine 3000(Thermo Scientific)混合，在 p6 板中轉(zhuǎn)染 20 × 104 人 MSCs/孔。 48 小時(shí)后，用 MSC 培養(yǎng)基中和后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并在 p96 板中稀釋成每孔 0.5 個(gè)細(xì)胞。 2周后，根據(jù)制造商的說明(SBI，System Biosciences)，用優(yōu)化的方法直接裂解細(xì)胞并進(jìn)行PCR表征。 通過人 IL-10 Quantikine ELISA 試劑盒(D1000B，R&D Systems)驗(yàn)證 IL-10 蛋白分泌。

Real-time PCR

如前所述進(jìn)行 RNA 提取和實(shí)時(shí) PCR。 用于擴(kuò)增 IL-10 的引物是：

正向 5'-GCC TAA CAT GCT TCG AGA TC-3';

反向 5'-TGA TGT CTG GGT CTT GGT

TC-3' ; IL-37：

正向 5'-TCA GCT GAA GAA GGA GAA ACT G-3';

反向 5'-TTA TCT GTC ACC CCA ACA GG-3'

研究?jī)?nèi)容

為了確定基因組編輯的 MSCs 直接細(xì)胞裂解和 PCR 表征的最有效方法，使用野生型 MSCs 比較了總共 12 種不同的方法，包括以前證明的方法和一些修改的方法。首先將 MSCs 接種到 96 板上，每孔有 1、10、102 和 103 個(gè)細(xì)胞。 過夜孵育后，用指定的細(xì)胞裂解方法直接裂解細(xì)胞。 一個(gè)通過 PCR 擴(kuò)增的 1106 bp DNA 片段用于評(píng)估從不同數(shù)量的 MSC 釋放 DNA 的效率。 使用 2 x PCR mix (Thermo Scientific) 進(jìn)行 PCR，含或不含 0.1% BSA 和 1% PVP40，這可以提高 PCR 效率并釋放聚合酶抑制作用。 數(shù)據(jù)顯示，方法 III (PK-T20) 和 XI (PK-Igepal-T20) 是最有效的方法，僅從 10 個(gè)細(xì)胞中成功擴(kuò)增了目標(biāo) DNA 片段(圖 1)。此外，DNA 片段可以從 10 到 103 個(gè)細(xì)胞成功擴(kuò)增，使其適用于低細(xì)胞數(shù)和高細(xì)胞數(shù)(圖 1)，因?yàn)樵鲋衬芰赡芤虿煌?MSC 克隆而異。 但是，添加 BSA 和 PVP40 并沒有提高效率。

方法III(PK-T20)通過Cas9將IL-10正確插入AASV1位點(diǎn)來表征MSC單克隆，IL-10是一種具有免疫抑制功能的重要抗炎因子。盡管MSCs已被廣泛研究用于治療自身免疫性系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病，它們的治療功效應(yīng)通過免疫抑制因子 IL-10 的過表達(dá)來增強(qiáng)。因此我們?cè)噲D將 IL-10 引入人類基因組安全港 AASV1 位點(diǎn)。gRNA 結(jié)構(gòu)和Cas9系統(tǒng)之前已被證明(圖2A)供體結(jié)構(gòu)和靶序列從SB(圖2A)獲得數(shù)據(jù)表明方法IIl(PK-T20)可以成功識(shí)別左臂PCR特征的集落(圖2B) .并通過右臂PCR(圖2C)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。然后通過實(shí)時(shí)PCR在沒有供體插入的菌落16(C16)和正確插入的野生型MSCs中測(cè)量IL-10的mRNA水平。數(shù)據(jù)顯示表明 C17 中 iL-10 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平遠(yuǎn)高于野生型和 C16(圖2D)?；蚪M編輯程序并未影響 MSC 的表型，包括細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)(圖 2E)和分化能力(圖2F)。在基因組編輯之前也得到了證實(shí)(補(bǔ)充圖 1)。此外，這也通過將另一個(gè)免疫抑制基因 IL-37 插入同一位點(diǎn)來驗(yàn)證[25](補(bǔ)充圖 2)。

我們?cè)谶@里證明了 PK-T20 方法可用于表征細(xì)胞數(shù)范圍為 10 到 1000 的 MSC 單克隆。通過使用該方法，我們成功地建立了在 AASV1 位點(diǎn)過度表達(dá) IL-10 或 IL-37 表達(dá)的 MSC 單克隆，可能具有偏倚承諾在未來的治療應(yīng)用。

圖 1. 直接細(xì)胞裂解和 PCR 的方法比較。 將間充質(zhì)干細(xì)胞接種到 96 板上，每孔 1、10、102 和 103 個(gè)細(xì)胞。 過夜孵育后，用指定的細(xì)胞裂解方法直接裂解細(xì)胞。 I：直接裂解法; 二：PK法; 三：PK-T20法;IV：PK-SDS-1法; V：PK-SDS-0.5法; VI：PK-SDS-0.1法; VII：NaOH法; VIII：KOH法; I X：NL法; X：NaOH-T20法; X I：PK-Igepal-T20法; XII：Amp(Extract-N-Amp? Blood PCR Kits)方法。 使用 2 x PCR 混合物(Thermo Scientific)進(jìn)行 PCR，含或不含 0.1% BSA 和 1% PVP40。

M：DNA; 箭頭顯示 1.0 或 1.5 kb 的 DNA 大小。

圖 2. 將 IL-10 插入 AASV1 位點(diǎn)的目標(biāo)。 (A) 供體和 gRNA 結(jié)構(gòu)。 (B) 通過放大左臂對(duì)基因組編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC) 單克隆進(jìn)行 PCR 表征。 箭頭顯示預(yù)測(cè)的 PCR 產(chǎn)物大小。 (C) 通過放大右臂對(duì)基因組編輯的 MSC 菌落進(jìn)行 PCR 表征。 箭頭顯示預(yù)測(cè)的 PCR 產(chǎn)物大小。 (D) 沒有供體插入的菌落 16 (C16)、正確插入的菌落 17 (C17) 和野生型 MSCs (NC) 中 IL-10 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平。 (E) MSC 單克隆 C17 通過流式細(xì)胞術(shù)用 MSC 標(biāo)志物進(jìn)行表征。 (F) MSC 單克隆 C17 可以分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。

M：DNA梯; 箭頭顯示 750 bp、1.0 或 2 kb 的 DNA 大小。