今天推薦的是由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和廈門大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科發(fā)表在American Journal of Reproductive Immunology的一篇文章，通訊作者是Qiong-Hua Chen教授。

文章摘要

問題：來自子宮內(nèi)膜異位癥患者的原代在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在研究中的應(yīng)用由于壽命短、激素反應(yīng)性去分化而受到限制。

研究方法：人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (hTERT) 誘導(dǎo)的永生化細(xì)胞 (iheESCs) 被慢病毒感染。通過 qRTPCR 檢查 mRNA 水平，并通過蛋白質(zhì)印跡定量蛋白質(zhì)表達(dá)。 CCK-8 和 EdU 測定被指定用于評(píng)估增殖。通過transwell測定評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲?？寺⌒纬稍囼?yàn)和裸鼠致瘤性試驗(yàn)用于評(píng)估集落形成和致瘤能力。

結(jié)果：與原代細(xì)胞相比，hTERT mRNA 和蛋白質(zhì)在 iheESCs 中的表達(dá)顯著高于原代細(xì)胞。 iheESCs 生長 42 代沒有形態(tài)變化，這比原代細(xì)胞的 18 代長得多。原代細(xì)胞和iheESCs在生長、遷移率和染色體核型上沒有明顯差異。此外，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 標(biāo)志物和雌激素/孕激素受體的表達(dá)保持不變。黃體酮和 cAMP 可以誘導(dǎo) iheESCs 的蛻膜化。雌激素增加iheESCs的增殖和遷移能力，脂多糖(LPS)誘導(dǎo)IL-1β和IL-6促進(jìn)炎癥反應(yīng)。與原代細(xì)胞一樣，iheESCs 的集落形成能力低于 Ishikawa 細(xì)胞。此外，致瘤性測定表明，iheESCs 不能在 BALB/c 裸鼠中引發(fā)腫瘤形成。

結(jié)論：本研究建立并表征了 iheESCs，它保持了原代細(xì)胞的細(xì)胞生理學(xué)并且不具有致瘤能力。

因此，iheESCs 可用作體外細(xì)胞模型來研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制。

研究背景

子宮內(nèi)膜異位癥的經(jīng)典定義是存在子宮內(nèi)位置之外的子宮內(nèi)膜組織。子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性炎癥性疾病，可導(dǎo)致慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)、不規(guī)則子宮出血和不孕癥。1,2 育齡女性盆腔子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率接近 10%。3 此外，子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)率子宮內(nèi)膜異位癥達(dá)6%-67%，部分患者需要3次或以上手術(shù)4。因此，子宮內(nèi)膜異位癥嚴(yán)重影響患者的身心健康、人際關(guān)系和經(jīng)濟(jì)狀況。

最廣泛接受的子宮內(nèi)膜異位癥理論是子宮內(nèi)膜組織的逆行月經(jīng)通過通暢的輸卵管進(jìn)入腹膜腔。5,6 因此，腹膜腔內(nèi)脫落的子宮內(nèi)膜病變的存活能力對于建立可行的植入物至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳特征在臨床上得到證實(shí)，有病史的家族中子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率遠(yuǎn)高于未受影響的女性。 7,8 另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位子宮內(nèi)膜有幾種與正常女性相比，基因組發(fā)生了改變。 9,10 此外，在位子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)異常的孕酮受體 (PR) 表達(dá)和孕激素抵抗，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性受損。 11,12 這些發(fā)現(xiàn)表明，女性在位子宮內(nèi)膜的基因組異常子宮內(nèi)膜異位癥可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥患者不孕并形成子宮內(nèi)膜異位癥病變。因此，關(guān)注在位子宮內(nèi)膜異常的研究對于揭示子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞是研究子宮內(nèi)膜異位癥必不可少的工具，但原代細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)過程中往往會(huì)發(fā)生去分化，包括激素和細(xì)胞因子反應(yīng)性的喪失、壽命短、遷移和侵襲的變化。因此，始終如一地供應(yīng)具有穩(wěn)定特性和長壽命的細(xì)胞對于研究應(yīng)用非常重要。該研究建立并表征了在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中保持原始形態(tài)的永生化細(xì)胞，并且生長速率、流動(dòng)性和上皮間充質(zhì)蛋白、雌激素/孕激素受體表達(dá)保持不變。觀察到iheESCs的雌激素刺激和炎癥反應(yīng)。綜上所述，iheESCs 可作為體外細(xì)胞模型來研究在位子宮內(nèi)膜的異常和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制。

研究內(nèi)容

1.通過感染慢病毒建立iheESCs

為了產(chǎn)生具有 hTERT 過表達(dá)的永生化細(xì)胞，慢病毒被包裝并用于感染在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。如圖 1A 所示，iheESCs 在第 5、15、25 和 35 段中穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白 (RFP)。 hTERT 的 mRNA 和蛋白質(zhì)在 iheESCs 中顯著增加(圖 1B，C)。與原代細(xì)胞相比，iheESCs 的形態(tài)沒有變化(圖 1D)。此外，iheESCs 可以傳代到 42 代，比原代細(xì)胞長得多(圖 1E)。

圖1.通過感染慢病毒建立永生化的人類在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞 (iheESCs)。 (A) 原代基質(zhì)細(xì)胞被帶有紅色熒光蛋白標(biāo)簽的慢病毒感染。 慢病毒感染后 hTERT mRNA (B) 和蛋白 (C) 的表達(dá)。 (D) 原代細(xì)胞和 iheESCs 的細(xì)胞形態(tài)。 (E) 通過連續(xù)培養(yǎng)處理的原代細(xì)胞和 iheESCs 的壽命。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 **P < .001, ***P < .0001。

2. iheESCs 的細(xì)胞生理學(xué)保持不變

為了進(jìn)一步監(jiān)測 iheESCs 的生理變化，檢查了 iheESCs 的生長和流動(dòng)性。原代細(xì)胞和 iheESCs 的生長曲線沒有顯著差異(圖 2A)。 iheESCs 的遷移和侵襲都與原代細(xì)胞相似(圖 2B，C)。此外，雌激素受體、孕激素受體和上皮間充質(zhì)標(biāo)記蛋白在原代細(xì)胞和 iheESCs 之間的表達(dá)是一致的(圖 2D)。經(jīng)過長期培養(yǎng)，iheESCs 中 ERs 和 PR 的 mRNA 表達(dá)與原代在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞相比保持不變，這與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞不同(圖 S1A-C)。為了區(qū)分上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，使用免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞角蛋白 18 和波形蛋白的表達(dá)。 iheESCs 和初級(jí)保持較高水平的波形蛋白，而細(xì)胞角蛋白 18 的表達(dá)較低(圖 2E)。為了進(jìn)一步研究細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)化，進(jìn)行核型分析以探索iheESCs的染色體情況如圖 2F，iheESCs 維持 23 對染色質(zhì)，表明 iheESCs 的核型保持正常。這些結(jié)果表明，iheESCs保持了原有的增殖和遷移能力，原代基質(zhì)細(xì)胞的特性和雌孕激素受體的表達(dá)沒有改變。

圖2. iheESCs 的細(xì)胞生理學(xué)沒有改變。 (A) 通過 CCK8 測定每 24 小時(shí)測定一次原代細(xì)胞和 iheESCs 的增殖。 (B) 通過 transwell 測定和量化分析評(píng)估的初級(jí) ells 和 iheESCs 的遷移(右)。 (C) 原代細(xì)胞的侵襲測定和 iheESCs 量化分析 (右)。 (D) EMT 標(biāo)志物、雌激素和孕激素受體在不同細(xì)胞中的表達(dá)。 (E) 通過免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的鑒定。 (F) iheESCs 的染色體核型分析和分選結(jié)果(下)。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 NS>0.05，*P < .01。

3. iheESCs 蛻膜化的誘導(dǎo)

為了進(jìn)一步確認(rèn) iheESCs 的蛻膜能力，使用 1 μM 孕酮和 0.1 mM cAMP 刺激 iheESCs 以誘導(dǎo)蛻膜化。 iheESCs 的形態(tài)從紡錘形變?yōu)樨S滿的圓形(圖 3A)。此外，IGFBP-1 和 PRL 的 mRNA 表達(dá)顯著增加(圖 3B，C)。因此，iheESCs 在黃體酮和 cAMP 的刺激下表現(xiàn)出足夠的蛻膜表型。

4. 在 iheESCs 中檢測到正常的雌激素應(yīng)激和炎癥反應(yīng)證實(shí)雌激素對細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用

進(jìn)行iheESCs、CCK8和EdU測定以檢查增殖和細(xì)胞分裂。如圖 4A 所示，iheESCs 的增殖隨著雌激素的刺激而顯著升高。在雌激素處理的細(xì)胞中，EdU 陽性細(xì)胞的百分比顯著增加(圖 4B)。此外, 雌激素處理的 iheESCs 更有能力遷移和入侵 (圖 4C, D)。這些結(jié)果表明正常的雌激素應(yīng)激反應(yīng)在iheESCs中呈現(xiàn)穩(wěn)定。為了檢查iheESCs是否保持正常的炎癥過程，采用qRT-PCR和Western印跡來測量LPS處理的iheESCs中IL-1β和IL-6的表達(dá)。 LPS 刺激增加了 IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)(圖 4E，F(xiàn))。這些結(jié)果表明iheESCs保持正常的炎癥反應(yīng)。

5. iheESCs 不具備致瘤能力

為了進(jìn)一步鑒定iheESCs的致瘤能力，采用集落形成試驗(yàn)和裸鼠致瘤性試驗(yàn)來解決iheESCs的致癌性。圖 5A 的結(jié)果表明，原代細(xì)胞和 iheESCs 的集落形成相似且明顯少于 Ishikawa 細(xì)胞。為了檢查iheESCs是否惡化并獲得致癌能力，將細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)。原代細(xì)胞和 iheESCs 無法觸發(fā)腫瘤形成，但陽性對照 Ishikawa 細(xì)胞成功形成腫瘤(圖 5B)。因此，這些結(jié)果暗示 iheESC 不具備致瘤能力

圖3. iheESCs 蛻膜化的誘導(dǎo)。 (A) 用黃體酮和 cAMP 處理觀察細(xì)胞形態(tài)。 (B) 蛻膜誘導(dǎo)后 IGFBP1 mRNA 的水平。 (C) 通過 qRT-PCR 分析的 PRL mRNA 的表達(dá)。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 ***P < .0001。

圖4. 在 iheESCs 中發(fā)現(xiàn)了正常的雌激素應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。 (A) 在雌激素刺激下 iheESCs 的增殖。 (B) EdU 檢測用于監(jiān)測細(xì)胞分裂和量化分析(右)。 (C)通過transwell檢測和定量分析(右)檢測到雌激素處理后的細(xì)胞遷移能力。 (D) 評(píng)估暴露于雌激素的細(xì)胞侵襲和定量分析 (右)。 (E) 脂多糖 (LPS) 處理后 IL-1β 和 IL-6 mRNA 的相對表達(dá)。 (F) 蛋白質(zhì)印跡法檢測 IL-1β 和 IL-6 的蛋白質(zhì)水平。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 **P < .001, ***P < .0001。

圖5. iheESCs 不具備致瘤能力。 (A) 用于評(píng)估 iheESCs 致癌潛力的集落形成試驗(yàn)。 (B) 進(jìn)行裸鼠致瘤性測定以評(píng)估 iheESCs 的致瘤能力

結(jié)論與討論

在這項(xiàng)研究中，我們通過轉(zhuǎn)染編碼 hTERT 的慢病毒載體建立并表征了永生化的人類子宮內(nèi)膜異位癥在位基質(zhì)細(xì)胞 (iheESCs)。 iheESCs 維持 hTERT 的高表達(dá)，在連續(xù)培養(yǎng) 42 代時(shí)保持原始形態(tài)。 iheESCs中雌激素/孕激素受體和EMT標(biāo)志物的表達(dá)與原代細(xì)胞保持穩(wěn)定一致。此外，iheESCs 保持正常生長和遷移和侵襲能力。 iheESCs 表現(xiàn)出由黃體酮和 cAMP 誘導(dǎo)的蛻膜化能力。在iheESCs中檢測到正常的雌激素和炎癥反應(yīng)。此外，iheESCs 不具備致瘤能力。因此，iheESCs可以成為研究子宮內(nèi)膜異常和子宮內(nèi)膜異位癥病理的理想工具細(xì)胞。

子宮內(nèi)膜與正常和子宮內(nèi)膜異位癥女性之間存在許多巨大差異。與正常子宮內(nèi)膜相比，在位子宮內(nèi)膜的增殖增加。13-15 與正常子宮內(nèi)膜相比，在位子宮內(nèi)膜具有更高的遷移和侵襲能力。16,17 我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，在位細(xì)胞中 EMT 水平顯著提高。 18 因此，在位子宮內(nèi)膜的高增殖、流動(dòng)性和 EMT 可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。通過轉(zhuǎn)染 hTERT 建立的 iheESCs 保留了原始的生長速率、移動(dòng)性和 EMT 水平。此外，iheESCs 在多代后仍保持間充質(zhì)細(xì)胞的特征。這些結(jié)果表明iheESCs的細(xì)胞生理沒有退化。因此，在子宮內(nèi)膜異位癥病理學(xué)研究中，使用iheESCs作為模型細(xì)胞替代原代細(xì)胞是可行的。

子宮內(nèi)膜是動(dòng)態(tài)的類固醇反應(yīng)組織，它經(jīng)歷重復(fù)的生理周期，包括連續(xù)的增殖、分化、分解和修復(fù)，所有這些都與類固醇激素有關(guān)。 19 孕酮及其受體調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的蛻膜化。 20 iheESCs 的蛻膜化被誘導(dǎo)黃體酮和cAMP，這表明iheESCs的生理仍然受到黃體酮的深度調(diào)節(jié)。此外，該iheESCs中的蛻膜化表明iheESCs可用于子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入的研究。另一方面，與炎癥相互作用的雌激素在維持子宮內(nèi)膜異位癥中起著至關(guān)重要的作用。 21,22 我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過 p38 上調(diào)細(xì)胞生長、流動(dòng)性和 EMT 水平上述測定表明，iheESCs 的生長和遷移受雌激素的調(diào)節(jié)，因此 iheESCs 的細(xì)胞活性受雌激素的影響。此外，在 iheESCs 中檢測到對 LPS 誘導(dǎo)的炎癥的反應(yīng)。因此，iheESCs可作為模型細(xì)胞系研究雌激素和炎癥過程對子宮內(nèi)膜異位癥的影響和機(jī)制。

此外，其他小組通過使用各種方法使細(xì)胞永生化，克服了原代培養(yǎng)的局限性。 Yuhki 等人 24 建立了人類永生化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系 KC02-44D，它保持正常的蛻膜能力和炎癥反應(yīng)。 Holdsworth 等人 25 報(bào)道，永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系保持純合子宮內(nèi)膜異位癥風(fēng)險(xiǎn)基因型和對激素(增殖和蛻膜變化)和炎癥的不同反應(yīng)。與保持原發(fā)性激素反應(yīng)和炎癥的 hTERT 永生化子宮內(nèi)膜細(xì)胞相同，iheESCs 保持較長的細(xì)胞壽命，可達(dá) 40 代。進(jìn)一步觀察到 iheESCs 的流動(dòng)性和 EMT 水平?jīng)]有變化。此外，iheESCs 是不完全轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，沒有惡性轉(zhuǎn)化。因此，iheESCs在更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域提供更長的使用壽命，并保證應(yīng)用安全。

建立永生化細(xì)胞的過程可能導(dǎo)致細(xì)胞退化，從而獲得致瘤能力。然而，iheESCs 不具備致瘤能力并保持原代細(xì)胞的生長特性。因此，我們的研究結(jié)果表明，iheESCs保持穩(wěn)定的特性和應(yīng)激反應(yīng)，可作為研究在位子宮內(nèi)膜異常和子宮內(nèi)膜異位癥病理的理想細(xì)胞模型。