第四節(jié)：hESC細胞傳代教程 

本視頻為廈門逸漠生物科技有限公司出品關(guān)于hESC細胞培養(yǎng)教程之：hESC細胞傳代，我們對每一步操作都做了演示，以便科研老師更好地理解hESC細胞傳代實驗過程。

hESC細胞培養(yǎng)教程之：hESC細胞傳代

一.傳代條件

細胞滿足以下條件之一，即需要進行細胞傳代：

1. 細胞匯合度達85%左右，移動視野觀察細胞生長狀態(tài)，整個皿密度均勻，沒有過大的克隆或者克隆過于致密的部分，一般皿中心部分比邊緣密度略大;一般情況下每4天傳代一次，即使克隆團較小，匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過5天；

2. 細胞匯合度較低，但干細胞集落過大，中央細胞生長不良；

二.傳代間隔和比例

1. 可根據(jù)細胞生長狀態(tài)和實驗需求按1:5~1:20的比列進行傳代；

2. 如果細胞正常，克隆匯合度85%, 大小均勻，建議按照1:10進行傳代；

3. 如果密度偏低，則可降低傳代比例，密度偏高，則增加傳代比例。

三.準備工作

1. 提前30 min將Immocell hESC完全培養(yǎng)基，Immocell Y-27632（10 mM）和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中，恢復至室溫；

2.吸取4 mL hESC完全培養(yǎng)基加入到離心管中，按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632（10 mM），充分混勻，恢復至室溫；

四.hESC細胞傳代步驟

1. 從培養(yǎng)箱中取出待傳代細胞，吸棄孔內(nèi)的hESC培養(yǎng)基，加入2 mL/孔的DPBS，輕輕搖晃并吸棄，再加入2 mL/孔的Immocell EDTA傳代工作液（0.5 mM）,使溶液完全覆蓋孔底，將培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中；

注意：保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸了，使其受熱均勻，不要疊放，設(shè)定消化時間10 min；

2. 吸棄6孔板中1孔的Matrigel包被液，加入預溫的 Y-27632+hESC完全培養(yǎng)基2 mL/孔在6孔板上做好標記（細胞名稱，代次，傳代比例，日期和操作人）；

3. 消化結(jié)束后，從培養(yǎng)箱中取出消化的細胞，顯微鏡下觀察細胞的變化，大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時即可終止消化，若大部分細胞細胞仍未變亮，則需要延長消化時間；

4. 將消化好的細胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜中，避免震蕩搖晃細胞，傾斜吸棄Immocell EDTA傳代工作液，加入2 mL/孔預溫的Y-27632+hESC完全培養(yǎng)基，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質(zhì)；

5.可輕柔吹打細胞1-2次；不能超過2次，避免將細胞吹打成單細胞狀態(tài)，注意避免刮擦細胞，有部分細胞（10-15%）未脫離基質(zhì)是正常，若有大量未脫離則需延長消化時間；

6.一次操作不要超過1個6孔板，當hESC培養(yǎng)基加入后要快速吸出。因為EDTA傳代工作效果在hESC培養(yǎng)基加入后會很快被終止，在hESC培養(yǎng)基加入后細胞又會很快貼壁，而hESC培養(yǎng)基不能長時間處于EDTA傳代工作液（<15min），所以收集接種細胞時操作必須快速。