背景介紹

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs)是來源于脂肪組織的干細(xì)胞，與其它成體干細(xì)胞一樣具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪組織均可用于分離ADSCs，其中鼠脂肪組織通常取自腹股溝處脂肪墊。

細(xì)胞形態(tài)

小鼠脂肪干細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞特點

1、具有自我更新及多向分化的潛能

2、來源充足

3、對供區(qū)的創(chuàng)傷較小

4、獲得率及體外擴(kuò)增速率高

材料準(zhǔn)備

脂肪干細(xì)胞專用培養(yǎng)基

PBS溶液(IMC-401)

0.25%胰蛋白酶細(xì)胞消化液 (IMC-501)

I型膠原酶溶液 (1 mg/mL)

實驗步驟

1. 3天齡到4周齡(推薦周齡小)大鼠或小鼠1只，麻醉處死，75%乙醇浸泡消毒3-5min。無菌條件下切開腹股溝皮膚，暴露腹股溝脂肪墊。

2. 鈍性剝離脂肪組織，清洗并去除筋膜組織及小血管。將脂肪墊剪碎，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。

3.加入3-4倍體積的0.1%(1 mg/ml) I型膠原酶溶液，37℃水浴振蕩約20 min，直至細(xì)胞混合物成乳狀濃稠液體。期間可吹打脂肪組織，輔助消化。

4.250×g，4℃，離心10min。注意離心機(jī)預(yù)冷至4℃。

5.小心吸去上層油脂，注意不要破壞位于下方的膠狀沉淀。加人5mL完全培養(yǎng)基，重懸沉淀，過40μM細(xì)胞篩到新的離心管中，再次離心10min。

6.重復(fù)洗滌一次，吸去上清。

7.加入8 mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中。

8.待細(xì)胞貼壁生長48h后首次觀察、換液。

9.換液時通過棄去培養(yǎng)基，從而去除未貼壁的細(xì)胞。

10.以后每兩天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合達(dá)80%-90%時，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次傳代。

注意事項

1. 全程無菌操作，小鼠要提前酒精浸泡防止污染，仔細(xì)剝離去除血管和筋膜組織。

2. 脂肪組織在剪碎的過程中不能研磨，以免破壞細(xì)胞。

3. 小鼠皮下脂肪前體細(xì)胞隨著小鼠周齡增大，誘導(dǎo)分化潛能逐漸下降，故建議選擇4周內(nèi)小鼠進(jìn)行實驗。

4. 剪開皮膚的剪刀需與取材的剪刀相區(qū)分，避免污染。

5. 需要的膠原酶量和消化時間需要根據(jù)具體情況相應(yīng)增減。如果消化已經(jīng)完全，未見明顯組織則可停?消化。

6. 消化完后的組織在離心前把離心機(jī)預(yù)冷，脂肪原代細(xì)胞在低溫既可保持良好的活力，又能便于細(xì)胞更好的與油脂分離。

大鼠小鼠脂肪干細(xì)胞鑒定

1. 形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)后，傳代2-3次，ADSCs呈現(xiàn)單層，梭狀或多枝狀的細(xì)胞形態(tài)，其直徑在25-30um，待細(xì)胞達(dá)到匯合時，它們形態(tài)上呈紡錘形，類似于成纖維細(xì)胞，貼壁較牢固。

2. 標(biāo)記物檢測

一般的標(biāo)準(zhǔn)為CD29、CD44、CD73、CD105為陽性(>90%);CD34、CD45、CD11b為陰性(<5%)。

3. 誘導(dǎo)分化實驗

在特定的誘導(dǎo)條件下，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。

不同代系免疫表型

三系分化鑒定