本視頻為廈門逸漠生物科技有限公司出品關(guān)于hESC細(xì)胞培養(yǎng)教程之：hESC細(xì)胞凍存，我們對(duì)每一步操作都做了演示，以便科研老師更好地理解hESC細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)過程。

hESC細(xì)胞培養(yǎng)教程之：hESC細(xì)胞凍存

一.凍存條件

1.顯微下觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞匯合度達(dá)85%左右可以收獲凍存，一般6孔板可收集2-4x106個(gè)活細(xì)胞/孔，可凍存一管；

二.準(zhǔn)備工作

1.準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的2 mL凍存管;標(biāo)記細(xì)胞名稱，代次，日期，操作人；

2.提前從4℃冰箱中取出Immocell hESC凍存液，置于室溫預(yù)溫，提前將梯度程序降溫盒置于4℃冰箱中預(yù)冷；

三.hESC細(xì)胞凍存步驟

1. 從培養(yǎng)箱中取出待凍存細(xì)胞，吸棄皿中的hESC培養(yǎng)基，加入2 mL/孔的DPBS，再吸棄;加入2 mL/孔的Immocell EDTA傳代工作液（0.5 mM）, 使溶液完全覆蓋孔底，將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中；

2. 注意：保持6孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸了，使其受熱均勻，不要疊放，設(shè)定消化時(shí)間10 min；

3. 消化結(jié)束后，從培養(yǎng)箱中取出消化的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞變化，大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基質(zhì)或漂起時(shí)即可終止消化，若大部分細(xì)胞細(xì)胞仍未變亮，則需要延長(zhǎng)消化時(shí)間；

4. 將消化好的細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜中，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜吸棄Immocell EDTA傳代工作液，搖勻預(yù)溫的Immocell hESC凍存液，每孔加入1mL凍存液,輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細(xì)胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中；

注意：Immocell hESC凍存液中的DMSO易沉積在溶液下部，如未搖勻可能造成開始用時(shí)DMSO濃度不夠，后面用的DMSO濃度過高，造成凍存細(xì)胞的不穩(wěn)定，將凍存細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中，置于-80℃過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長(zhǎng)期保存，或使用程控降溫設(shè)備將細(xì)胞降至-80℃以下后，直接轉(zhuǎn)入液氮儲(chǔ)存。