本視頻為廈門(mén)逸漠生物科技有限公司出品關(guān)于hESC細(xì)胞培養(yǎng)教程之：hESC細(xì)胞復(fù)蘇，我們對(duì)每一步操作都做了演示，以便科研老師更好地理解hESC細(xì)胞復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

hESC細(xì)胞培養(yǎng)教程之：hESC細(xì)胞復(fù)蘇

一.準(zhǔn)備工作

1. 將恒溫水浴鍋調(diào)至37℃預(yù)熱，提前30 min將DMEM/F12培養(yǎng)基，Immocell hESC完全培養(yǎng)基，Immocell Y-27632（10 mM） 和Corning Matrigel包被好的6孔板放置生物安全柜中，恢復(fù)至室溫；

2. 取15 mL離心管，并做上標(biāo)記；吸取10 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基加到離心管中；

3. 取15 mL離心管，并做上標(biāo)記；吸取4 mL Immocell hESC完全培養(yǎng)基加到離心管中；按照1:4000比例加入1 μl的Immocell Y-27632（10 mM），充分混勻，恢復(fù)至室溫；

注意：不要在37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基

二.hESC細(xì)胞復(fù)蘇

1.從液氮罐中取出待復(fù)蘇的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移置于干冰泡沫箱中，取出一支待復(fù)蘇的細(xì)胞置于37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時(shí)取出；75%酒精無(wú)塵紙擦拭凍存管表面，放入生物安全柜；

2.將細(xì)胞懸液移至15 mL離心管中，隨后逐滴緩慢加入10 mL DMEM/F12，輕柔晃動(dòng)混勻細(xì)胞，160 g離心5 min；

3.離心完后可看到離心管底部有細(xì)胞沉淀，將離心好的細(xì)胞置于生物安全柜中，吸棄上清，盡量吸盡，但是注意不要吸起細(xì)胞沉淀，加入預(yù)溫的4 mL Y-27632+hESC完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞沉淀，混勻細(xì)胞，盡量避免反復(fù)吹打，以免細(xì)胞團(tuán)被吹散成單細(xì)胞；

4.吸棄預(yù)包被6孔板中2孔的Matrigel包被液；將混勻的細(xì)胞按照2 mL/孔接種到2孔中；

5.將新接種的細(xì)胞在6孔板做上標(biāo)記，水平十字搖勻三次；顯微鏡下50%細(xì)胞呈4-10個(gè)聚集的團(tuán)塊，密度為10%-20%；

6.將培養(yǎng)皿置于37℃ 5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中;再次水平十字搖勻三次，培養(yǎng)18-24小時(shí)后，觀察到細(xì)胞貼壁良好；

7.更換新鮮的hESC完全培養(yǎng)基，之后每天更換；

hESC細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

1.培養(yǎng)基一定恢復(fù)室溫；

2.細(xì)胞解凍時(shí)應(yīng)在冰晶未完全消失時(shí)及時(shí)取出，不能等到細(xì)胞融化；

3.離心完的細(xì)胞沉淀重懸不可反復(fù)吹打；

4.離心后的細(xì)胞沉淀會(huì)出現(xiàn)不容易吹不散的情況，在吸棄上清液可剩余10-15 μl，用手指輕彈離心管底部，使細(xì)胞均勻分散。