基本信息

英文標題：A Novel Luciferase-Based Reporter Gene Technology for Simultaneous Optical and Radionuclide Imaging of Cells

中文標題：基于分裂式熒光素酶的分子張力傳感器實現(xiàn)生物力學信號生物發(fā)光可視化

發(fā)表期刊：《International Journal of Molecular Sciences》

影響因子：5.6

作者單位：

1.Department of Radiology and Nuclear Medicine, Erasmus MC Cancer Institute, University Medical Center Rotterdam, 3015 CE Rotterdam, The Netherlands

2.Department of Molecular Genetics, Erasmus MC Cancer Institute, University Medical Center Rotterdam, 3015 CE Rotterdam, The Netherlands

3.Promega Corporation, Madison, WI 53711, USA

作者信息：

Natasa Gaspar, Maryana Handula, Marcus C.M. Stroet

研究背景

隨著基因和細胞治療的發(fā)展，非侵入性、高靈敏度的多模態(tài)成像技術成為監(jiān)測細胞治療的關鍵需求。傳統(tǒng)成像方法(如生物發(fā)光成像BLI和放射性核素成像SPECT/PET)各有優(yōu)劣：BLI靈敏度高但穿透力弱，SPECT/PET可深部成像但需特異性探針。本研究基于NanoLuc熒光素酶系統(tǒng)，開發(fā)了一種新型雙模態(tài)報告基因技術，通過膜錨定的大亞基(TM-LgBiT)與放射性標記的小肽(HiBiT)互補結合，實現(xiàn)光學(BLI)與核素(SPECT)同步成像，旨在解決現(xiàn)有技術信號衰減、探針特異性不足及臨床轉化困難的問題。

研究方法

研究構建了跨膜錨定的LgBiT報告基因(TM-LgBiT)，并通過固相合成法設計放射性標記的HiBiT肽(DOTA-6-Ahx-HiBiT)。體外實驗驗證了TM-LgBiT與HiBiT的高親和力(KD=0.7 nM)，并通過流式分選獲得穩(wěn)定表達的PC-3和HEK-293T細胞系。體內實驗中，小鼠皮下移植TM-LgBiT陽性/陰性腫瘤，注射放射性探針(111In標記)后，通過SPECT/CT和BLI同步成像，結合生物分布分析驗證特異性。此外，通過免疫熒光和阻斷實驗進一步確認靶向性。

實驗結果

圖1：雙模態(tài)報告基因技術原理示意圖

示意圖展示了TM-LgBiT(跨膜錨定的大亞基)與放射性標記的HiBiT肽(DOTA-6-Ahx-HiBiT)的結合機制。LgBiT通過PDGFR跨膜結構域固定在細胞膜表面，HiBiT探針攜帶DOTA螯合劑標記111In。兩者互補結合后激活NanoLuc酶活性，催化底物產(chǎn)生生物發(fā)光信號(BLI)，同時放射性核素實現(xiàn)SPECT成像。該設計避免了傳統(tǒng)多報告基因的復雜性，單基因即可支持雙模態(tài)成像。

圖2：HiBiT探針體外結合親和力與特異性驗證

通過表面等離子體共振(SPR)測定，DOTA-6-Ahx-HiBiT與TM-LgBiT的親和力(KD=0.7 nM)顯著優(yōu)于無連接臂的HiBiT(KD=6.8 nM)。放射性標記后，111In-DOTA-6-Ahx-HiBiT在TM-LgBiT陽性細胞中的結合信號比陰性對照高5倍(p<0.01)，而BLI信號未受影響，證明探針標記未破壞互補活性。

圖3：活體BLI成像顯示快速特異性信號

在PC-3腫瘤模型中，靜脈注射HiBiT探針后30分鐘，BLI信號在TM-LgBiT陽性腫瘤區(qū)域顯著增強(信噪比提高10倍)，而陰性腫瘤無信號。結果表明，該系統(tǒng)可在活體內快速(<2小時)實現(xiàn)高特異性光學成像，且探針修飾不影響功能。

圖4：SPECT/CT成像與腫瘤靶向性驗證

SPECT/CT顯示，TM-LgBiT陽性HEK-293T腫瘤在注射后1小時即出現(xiàn)放射性富集(3.6倍于對照)，且信號特異性隨時間增強。生物分布分析表明，腫瘤攝取達11.73% ID/g，腎臟高攝取(59.3% ID/g)提示探針主要通過腎排泄，需后續(xù)優(yōu)化藥代動力學。

圖5：阻斷實驗與免疫熒光驗證

過量冷探針(100倍)使腫瘤放射性攝取下降至2.30% ID/g(p<0.05)，證實探針靶向性。免疫熒光染色顯示TM-LgBiT(HA標簽)在腫瘤細胞膜高表達，與成像結果一致，進一步驗證系統(tǒng)可靠性。

圖6：雙模態(tài)成像協(xié)同性分析

BLI與SPECT信號在TM-LgBiT腫瘤中高度同步(R2=0.89)，離體生物分布顯示腫瘤放射性攝取與BLI強度正相關(p<0.01)。雙模態(tài)互補性為深層組織定量(SPECT)與高靈敏篩查(BLI)提供了協(xié)同解決方案。

研究結論

該技術成功實現(xiàn)了雙模態(tài)成像：BLI在30分鐘內檢測到腫瘤特異性信號(信噪比提高10倍)，SPECT/CT在2小時內顯示靶向腫瘤的放射性富集(11.73% ID/g)。生物分布表明腎臟為主要排泄途徑，阻斷實驗證實探針特異性。研究首次證明NanoLuc系統(tǒng)在活體中的互補結合能力，為細胞治療(如CAR-T)的實時監(jiān)測提供了高靈敏、高特異性的工具，但需進一步優(yōu)化探針穩(wěn)定性及免疫原性以推動臨床轉化。