基本信息

英文標(biāo)題：Design of Selective PARP-1 Inhibitors and Antitumor Studies

中文標(biāo)題：選擇性PARP-1抑制劑的設(shè)計(jì)與抗腫瘤研究

發(fā)表期刊：《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》

影響因子：6.9

作者單位：山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

作者信息：Zhang Yiting;Li Xiangqian;Liu Fang;Bai Xiaoyi;Liu Xiaochun;Sun Hao;Gao Chenxia;Lin Yuxi;Xing Pan;Zhu Jiqiang;Liu Ruihua;Wang Zemin;Dai Jiajia;Shi Dayong

研究背景

PARPs參與DNA損傷修復(fù)等細(xì)胞過程，PARP-1是PARP家族中最豐富的成員。

抑制PARP-1可以增加DNA損傷積累，導(dǎo)致雙鏈斷裂，通過同源重組修復(fù)。

PARP-1抑制劑已用于抗癌治療，但血液系統(tǒng)毒性限制了其應(yīng)用，可能因?yàn)橥瑫r(shí)抑制了PARP-2。

設(shè)計(jì)高度選擇性的PARP-1抑制劑可以減少毒性副作用，滿足腫瘤治療需求。

已開發(fā)出少量選擇性PARP-1抑制劑，但目前市場上尚無此類產(chǎn)品。

溴酚天然產(chǎn)物及其衍生物具有廣泛的生物活性，包括抗腫瘤作用。

研究團(tuán)隊(duì)合成了B4衍生物的六個(gè)系列，并鑒定出具有高活性和選擇性的化合物I16。

新型化合物通過影響特定氨基酸殘基提供高度的選擇性。

對PARP-1抑制譜的理解有助于設(shè)計(jì)選擇性PARP-1抑制劑。

研究方法

5.1 化學(xué)部分

所有商業(yè)試劑購入后未經(jīng)進(jìn)一步提純或蒸餾直接使用。

測定熔點(diǎn)使用Griffin裝置，結(jié)果未經(jīng)校正。

NMR(1H, 13C)數(shù)據(jù)使用Bruker AV-600光譜儀獲得，化學(xué)位移以ppm表示(TMS作為內(nèi)標(biāo))。

NMR信號的多重性縮寫：s = 單峰，d = 雙峰，t = 三重峰，q = 四重峰，m = 多重峰。

柱色譜使用200-300目硅膠。

高分辨率質(zhì)譜(HRMS)使用HPLC-Q-Tof MS (Micro)光譜儀獲得。

所有最終產(chǎn)品的純度通過分析HPLC確定為>95%。

5.2 化合物合成

提供了D1-D13化合物的通用合成步驟。

合成過程中使用了N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、碳酸鉀和乙醇等試劑。

5.3 PARP-1蛋白質(zhì)的突變、表達(dá)和純化

使用DNA點(diǎn)突變技術(shù)對PARP-1質(zhì)粒進(jìn)行三次點(diǎn)突變。

將突變后的質(zhì)粒和未突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK-293 T細(xì)胞中。

細(xì)胞裂解后，使用抗-FLAG M2磁珠純化PARP-1蛋白質(zhì)。

5.4 酶抑制實(shí)驗(yàn)

使用PARP-1和PARP-2的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行酶抑制實(shí)驗(yàn)。

通過96孔板酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測化合物對提取的PARP1和突變PARP-1的抑制效果。

5.5 分子對接研究

使用CDOCKER模塊進(jìn)行分子對接研究，分析了受體-配體相互作用。

5.6 SPR光譜分析

使用SPR技術(shù)檢測化合物I16與PARP-1和突變PARP-1的相互作用。

5.7 細(xì)胞培養(yǎng)

列出了用于實(shí)驗(yàn)的各種人類癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞系的來源和培養(yǎng)條件。

5.8 細(xì)胞活力測定

使用SRB或CCK-8法測定化合物的細(xì)胞活力抑制效果。

5.9 集落形成實(shí)驗(yàn)

通過觀察Hela和SK-OV-3細(xì)胞在不同濃度I16處理下的集落形成情況來評估其抗腫瘤效果。

5.10 Hoechst 33258染色

使用Hoechst 33258染色觀察SK-OV-3細(xì)胞核形態(tài)。

5.11 細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)

通過細(xì)胞熱位移實(shí)驗(yàn)分析I16或奧拉帕利對SK-OV-3細(xì)胞的熱穩(wěn)定性影響。

5.12 西部印跡分析

使用西部印跡技術(shù)分析SK-OV-3細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

5.13 活性氧物種檢測

通過流式細(xì)胞儀檢測I16處理后的SK-OV-3細(xì)胞中的活性氧物種。

5.14 體內(nèi)抗腫瘤活性評價(jià)

在BALB/c-nude小鼠體內(nèi)評估了I16的抗腫瘤活性。

5.15 體內(nèi)毒性安全評價(jià)

進(jìn)行了I16的急性毒性和亞急性毒性實(shí)驗(yàn)。

5.16 藥代動力學(xué)方法

在Sprague-Dawley大鼠體內(nèi)進(jìn)行I16的藥代動力學(xué)分析。

5.17 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，使用Student's t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：市售的PARP-1/2抑制劑(A1-A6)和報(bào)道的選擇性PARP-1抑制劑(B1-B6)

(A) Olaparib (A1) 與PARP-1和PARP-2的晶體結(jié)構(gòu)。PARP-1(PDB: 7KK4)和PARP-2(PDB: 4TVJ)分別以淺藍(lán)色和綠色表示。S位點(diǎn)也在右上角的表面表示中顯示。

(B) 鉛化合物B4與PARP-1結(jié)合的示意圖。

(C) 選擇性PARP-1抑制劑的設(shè)計(jì)。

反應(yīng)條件和試劑：

(a) K2CO3, DMF, 80°C, 8小時(shí);

(b) C5H5N, DCM, 室溫, 4小時(shí);

(c) Et3N, DCM, 室溫, 4小時(shí);

(d) CH3COOH, C2H5OH, 90°C, 2小時(shí)。

表1. 溴酚硫代半縮氨酸衍生物對PARP-1的抑制活性。

表2. 溴酚硫代半縮氨酸衍生物對PARP-1/2的抑制活性。

表3. H19, I15, I16, I19, B4 和 A1 對PARP-1和PARP-2的IC50值。

(A) I16與PARP-1(PDB代碼5A00)的預(yù)測結(jié)合模型。

(B) I16與PARP-1在2D圖上的相互作用。

(C) I16與PARP-2(PDB代碼4TVJ)的預(yù)測結(jié)合模型。

(D) I16與PARP-2在2D圖上的相互作用。

(A) 使用SPR評估I16對PARP-1蛋白的親和力。

(B) 使用SPR評估I16對突變PARP-1蛋白的親和力。

表4. 化合物I16對PARP-1和突變PARP-1的IC50值。

表5. 化合物I16對各種癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的抑制活性。

(A) I16對不同癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的生長抑制活性。***P < 0.001 與HCC1937相比。

(B) 通過CCK8試驗(yàn)確定I16對SK-OV-3細(xì)胞的抑制活性。SK-OV-3細(xì)胞用不同濃度的I16處理24、48和72小時(shí)。

(C) I16對SK-OV-3和Hela細(xì)胞板的克隆形成抑制效應(yīng)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)表示。**P < 0.01, ***P < 0.001，與對照組相比。

(A) I16對SK-OV-3細(xì)胞遷移的影響(放大倍數(shù)，100×)。

(B) I16對Hela細(xì)胞遷移的影響(放大倍數(shù)，100×)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001，與對照組相比。

I16誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞凋亡。

(A) I16處理后SK-OV-3細(xì)胞核形態(tài)的變化(放大倍數(shù)，100×)。

(B) 經(jīng)過36小時(shí)I16處理后SK-OV-3細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞儀檢測。

圖8：I16提高了SK-OV-3細(xì)胞中PARP-1/2的穩(wěn)定性

(A) I16對PARP-1穩(wěn)定性的影響。

(B) I16對PARP-2穩(wěn)定性的影響。Olaparib作為陽性對照。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)表示。*P < 0.05，與Olaparib相比。

(A) γ-H2AX的免疫熒光分析。

(B) γ-H2AX的蛋白質(zhì)印跡分析。

(C) I16誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞中ROS積累，通過流式細(xì)胞儀分析。

(D) I16抑制MCM復(fù)合物。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)表示。**P < 0.01, ***P < 0.001，與對照組相比。

圖10：I16抑制Hela移植瘤的生長

(A) 每組切除的腫瘤代表性照片。

(B) 每組連續(xù)35天的腫瘤體積。

(C) 每組連續(xù)35天的體重。

(D) Hela腫瘤中Ki67和γ-H2AX的表達(dá)水平通過免疫組化分析。圖片在100×放大倍數(shù)下拍攝。

(E) 使用Hela移植瘤組織進(jìn)行γ-H2AX表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 6)表示。**P < 0.01, ***P < 0.001，與載體組相比。

圖11：I16抑制SK-OV-3移植瘤的生長

(A) 每組切除的腫瘤代表性照片。

(B) 每組連續(xù)31天的腫瘤體積。

(C) 每組連續(xù)31天的體重。

(D) Hela腫瘤中Ki67和γ-H2AX的表達(dá)水平通過免疫組化分析。圖片在100×放大倍數(shù)下拍攝。

(E) 使用SK-OV-3移植瘤組織進(jìn)行γ-H2AX表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 6)表示。*P < 0.05, ***P < 0.001，與載體組相比。

圖12：I16在體內(nèi)的安全性評估

(A) 處理14天的小鼠體重，單獨(dú)使用載體(0.5% CMC-Na)和I16(500、1000和2000 mg/kg)。

(B) 處理14天的小鼠體重，使用載體(0.5% CMC-Na)和I16(1000 mg/kg·天?)。

(C) 對處理14天的小鼠的心、肝、腎、肺和脾組織進(jìn)行H&E染色。圖片在200×放大倍數(shù)下拍攝。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 10)表示。

研究結(jié)論

設(shè)計(jì)并合成了一系列針對PARP-1的選擇性抑制劑。

化合物I16在PARP-1抑制活性和選擇性上表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。

I16能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、遷移，并誘導(dǎo)凋亡。

I16在腫瘤細(xì)胞移植模型中的抑制效果優(yōu)于陽性對照藥物Olaparib。

I16在口服高劑量時(shí)表現(xiàn)出良好的安全性。

確定了S位點(diǎn)作為設(shè)計(jì)選擇性PARP抑制劑的潛在位點(diǎn)。

S位點(diǎn)的關(guān)鍵氨基酸突變會影響化合物與PARP-1的結(jié)合。

研究成果為開發(fā)安全、高效、選擇性的PARP-1抑制劑提供了新的策略和化學(xué)實(shí)體。