乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，有超過(guò)2.5億人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我國(guó)，人數(shù)接近1億人。NTCP工具細(xì)胞，特別是外源表達(dá)NTCP的肝癌細(xì)胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重現(xiàn)性佳的特點(diǎn)，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演著至關(guān)重要的角色。這些細(xì)胞模型能夠有效模擬HBV的感染過(guò)程，為研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒復(fù)制以及藥物篩選提供了一個(gè)強(qiáng)大而便捷的體外平臺(tái)。它們不僅有助于揭示HBV感染的分子機(jī)制，如DDX3作為宿主限制因子阻礙cccDNA轉(zhuǎn)錄，GPC5作為附著因子在感染入胞過(guò)程中的作用，還能通過(guò)直接與NTCP相互作用或下調(diào)NTCP表達(dá)來(lái)篩選和驗(yàn)證抗病毒藥物的活性，例如環(huán)孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，這些工具細(xì)胞還促進(jìn)了對(duì)HBV宿主特異性分子的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)展支持HBV感染的小動(dòng)物模型提供了可能，這對(duì)于乙肝相關(guān)研究和藥物開(kāi)發(fā)具有重大意義。

基本信息

英文標(biāo)題：Novel function of SART1 in HNF4a transcriptional regulation contributes to its antiviral role during HBV infection

中文標(biāo)題：含三方基序蛋白65(TRIM65)通過(guò)靶向HNF4α抑制乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)錄

發(fā)表期刊：《Journal of Hepatology》

影響因子：25.7

作者單位：

1.State Key Laboratory of Virology and Hubei Province Key Laboratory of Allergy and Immunology, Institute of Medical Virology, School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, Wuhan, China

2.Department of Clinical Laboratory, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan, China

3.State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan, China

作者信息：

Yan Teng, Zaichao Xu, Kaitao Zhao

研究背景

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是全球重大健康威脅，其共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)的持續(xù)存在是治愈慢性乙肝的主要障礙。宿主因子SART1此前被報(bào)道通過(guò)調(diào)控干擾素刺激基因(ISGs)抑制丙型肝炎病毒(HCV)，但其在HBV感染中的作用尚不明確。本研究旨在揭示SART1是否通過(guò)調(diào)控HBV關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子影響cccDNA轉(zhuǎn)錄，從而抑制HBV復(fù)制。研究聚焦于SART1對(duì)肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)的調(diào)控機(jī)制，以探索新型抗HBV治療靶點(diǎn)。

研究方法

SART1通過(guò)直接結(jié)合HNF4α的P1啟動(dòng)子區(qū)域(-309至-288位點(diǎn))，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而降低HBV核心啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的cccDNA轉(zhuǎn)錄。該作用獨(dú)立于干擾素信號(hào)通路，且在小鼠模型中證實(shí)SART1過(guò)表達(dá)顯著抑制HBV復(fù)制。研究首次揭示SART1通過(guò)雙重機(jī)制(調(diào)控ISGs和HNF4α)抗病毒，為靶向宿主因子治療慢性乙肝提供了新思路。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：SART1敲低增強(qiáng)HBV復(fù)制而過(guò)表達(dá)抑制病毒活性

通過(guò)shRNA敲低SART1后，HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV RNA(2.5倍↑)、HBsAg(3.1倍↑)及病毒顆粒(4倍↑)顯著增加(p<0.01);反之，過(guò)表達(dá)SART1使HBV RNA下降70%(p<0.001)，但cccDNA水平未受影響，表明SART1通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄而非cccDNA穩(wěn)定性抑制病毒。

圖2：SART1抗HBV作用獨(dú)立于干擾素通路

在JAK抑制劑(Tofacitinib)處理或IFNAR2敲除的HepG2細(xì)胞中，SART1過(guò)表達(dá)仍顯著降低HBV RNA(p<0.01)，且干擾素標(biāo)志基因(MX1、ISG15)未上調(diào)，證實(shí)其抗病毒機(jī)制不依賴(lài)經(jīng)典干擾素信號(hào)。

圖3：SART1特異性抑制HBV核心啟動(dòng)子活性

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)顯示，SART1過(guò)表達(dá)使HBV核心啟動(dòng)子活性下降65%(p<0.001)，但對(duì)SP1或AP1驅(qū)動(dòng)的啟動(dòng)子無(wú)影響。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)SART1未直接結(jié)合HBV cccDNA，提示其通過(guò)宿主因子間接調(diào)控。

圖4：SART1抑制HNF4α與cccDNA結(jié)合

ChIP-qPCR顯示，SART1過(guò)表達(dá)使HNF4α與cccDNA的結(jié)合減少60%(p<0.01)，而突變HNF4α結(jié)合位點(diǎn)或過(guò)表達(dá)HNF4α可完全逆轉(zhuǎn)SART1的抗病毒效應(yīng)，證明HNF4α是SART1的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5：小鼠模型中驗(yàn)證SART1體內(nèi)抗病毒效果

AAV-HBV感染小鼠中，肝臟過(guò)表達(dá)SART1使血清HBsAg降低80%(p<0.001)，肝組織HBV DNA減少2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí);shSart1處理則顯著促進(jìn)病毒復(fù)制(HBsAg↑2倍，p<0.01)，證實(shí)SART1在體內(nèi)的雙重調(diào)控作用。

圖6：SART1直接結(jié)合HNF4α啟動(dòng)子抑制其轉(zhuǎn)錄

雙熒光素酶報(bào)告和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SART1通過(guò)結(jié)合HNF4α P1啟動(dòng)子近端區(qū)域(-309至-288)抑制其活性(熒光素酶活性下降70%，p<0.001)。突變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)后，SART1的抑制作用完全消失，明確其直接調(diào)控機(jī)制。

研究結(jié)論

SART1通過(guò)直接結(jié)合HNF4α的P1啟動(dòng)子區(qū)域(-309至-288位點(diǎn))，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而降低HBV核心啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的cccDNA轉(zhuǎn)錄。該作用獨(dú)立于干擾素信號(hào)通路，且在小鼠模型中證實(shí)SART1過(guò)表達(dá)顯著抑制HBV復(fù)制。研究首次揭示SART1通過(guò)雙重機(jī)制(調(diào)控ISGs和HNF4α)抗病毒，為靶向宿主因子治療慢性乙肝提供了新思路。