基本信息

英文標題：A20-OVA Nanoparticles Inhibit Allergic Asthma in a Murine Model.

中文標題：A20-OVA納米顆粒在小鼠模型中抑制過敏性哮喘。

發(fā)表期刊：《Inflammation》

影響因子：4.5

作者單位：

1.Department of Pediatric Otolaryngology, Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 1033 Qinghu Blvd, Shenzhen, 518101, China

2.The Research Center of Allergy & Immunology, School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen, China

作者信息：Xiang-Qian Luo,1 Jian-Wen Zhong,1 Shu-Yao Qiu,1 Min Zhi,1 Li-Qiang Yang,1 Yi-Long Zhou,1Fen-Xuan Zhou,1 Ping-Chang Yang,2 Da-Bo Liu,1 and Li-Hua Mo.

研究背景

在過敏性哮喘的發(fā)病機制中，Th2細胞的偏移扮演著關(guān)鍵角色，而調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)和調(diào)節(jié)性細胞因子對于維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要。本研究旨在探究聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)-卵清蛋白(OVA)+ A20(一種泛素E3連接酶)納米疫苗對小鼠模型中過敏性哮喘的抑制效果。研究中，A20和OVA被封裝進PLGA中，形成納米疫苗(PLGA-OVA+A20)。通過開發(fā)一個以O(shè)VA為特定抗原的過敏性哮喘小鼠模型，研究測試了PLGA-OVA+A20納米疫苗在維持氣道組織免疫平衡中的作用。結(jié)果表明，PLGA-OVA+A20納米疫苗通過抑制Th2炎癥反應和促進氣道組織中Treg細胞的生成，有效抑制了小鼠的哮喘反應。研究結(jié)論認為，PLGA-OVA+A20納米疫苗顯著抑制了敏感化小鼠的氣道過敏反應，主要通過促進Treg細胞的生成和IL-10的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明PLGA-OVA+A20在治療過敏性哮喘方面具有潛在的轉(zhuǎn)化應用價值。

研究方法

在實驗中，首先制備了重組A20蛋白及其突變體，通過將A20基因構(gòu)建到PAML-C5ET載體中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞，陽性克隆的質(zhì)粒經(jīng)過KpnI和EcoRI消化后，目標片段被連接到PET-32a載體中，并轉(zhuǎn)化到BL21中表達。接著，通過親和色譜純化A20蛋白，并使用離子交換柱和ToxinEraser Endotoxin Removal Kit去除內(nèi)毒素。制備PLGA-OVA+A20納米顆粒時，將OVA+A20與PLGA共溶于二氯甲烷和丙酮中，通過探針超聲形成初級乳液，再加入含聚乙烯醇的水溶液中形成二級乳液，經(jīng)過攪拌過夜后蒸發(fā)有機相，用蒸餾水洗滌并離心收集納米顆粒。使用動態(tài)光散射技術(shù)測定納米顆粒的大小。通過將凍干的納米顆粒溶解在含1% SDS和0.05 mol/L NaOH的水相中，測定蛋白質(zhì)濃度，并通過透析袋收集釋放的蛋白質(zhì)量。在誘導過敏性氣道炎癥方面，使用雌性BALB/c小鼠，通過腹腔注射OVA和氫氧化鋁混合物進行致敏，然后用含有OVA、A20和OVA+A20的鼻滴處理小鼠7天，通過吸入不同濃度的甲酰膽堿測量氣道阻力，并在實驗結(jié)束時收集肺組織和支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行分析。使用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清和BALF中的細胞因子水平。通過流式細胞術(shù)分析脾細胞和T細胞的增殖，其中脾細胞用APC-CD4、FITC-CD25和PE-Foxp3抗體標記，而T細胞則用CFSE標記后與樹突狀細胞共培養(yǎng)。最后，通過Student’s t test和ANOVA進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以p值小于0.05作為顯著性標準。

實驗結(jié)果

圖1. 本研究涉及A20基因的克隆、表達和純化。

首先，通過限制性酶切分析確認了重組hyastatin-pET-28a(+)質(zhì)粒(含有A20 DNA)的成功構(gòu)建。接著，利用原核表達系統(tǒng)表達A20蛋白，并通過蛋白質(zhì)印跡顯示A20為可溶性蛋白。具體來說，1號樣本為誘導前，2號樣本為誘導后，3號樣本為超聲破碎后的上清液，4號樣本為超聲破碎后的沉淀物。進一步地，通過純化步驟得到了A20蛋白及其突變體(mA20)，并使用分子標記(MW)進行了驗證。最后，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)評估了A20的生物活性，結(jié)果顯示了A20的活性，數(shù)據(jù)代表了三次獨立實驗的平均值±標準差。

圖2. 在這項研究中，我們探討了OVA+A20對小鼠哮喘癥狀的影響。

每組6只哮喘模型小鼠接受了圖中X軸所示的不同處理程序。研究結(jié)果包括：a) 小鼠對甲酰膽堿吸入反應的氣道阻力記錄;b) 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的炎癥細胞計數(shù);c) BALF中的Th2細胞因子水平;d) 血清中針對OVA的特異性IgE水平;e) 代表性的肺組織病理學圖像(放大200倍)。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)。統(tǒng)計分析采用ANOVA加Dunnett’s檢驗，*p < 0.001表示與OVA組相比有顯著性差異。

圖3. 在本研究中，作者對OVA+A20負載的PLGA納米粒子進行了特性分析。

首先，通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)觀察了納米粒子的形態(tài)，得到了清晰的圖像。其次，利用動態(tài)光散射光譜(DLS)技術(shù)測定了納米粒子的尺寸分布，這是一種通過測量光強波動來確定懸浮液中小顆?；蛉芤褐芯酆衔锍叽绶植嫉姆椒āＷ詈?，評估了OVA+A20負載的PLGA納米粒子的體外累積蛋白釋放效率，這涉及到將納米粒子溶解并透析，隨后通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以了解蛋白的釋放情況。這些結(jié)果為作者提供了納米粒子的詳細特性，包括形態(tài)、尺寸和蛋白釋放效率。

圖4. 在本研究中，作者探究了納米疫苗在過敏性哮喘小鼠模型中的治療效果。

小鼠接受了如圖X軸所示的不同處理程序。研究結(jié)果包括：a) 通過ELISA檢測的小鼠血清中針對OVA的特異性IgE水平;b) 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的炎癥細胞計數(shù);c) 對甲酰膽堿吸入反應的氣道阻力;d) 代表性的肺組織組織學圖像(放大200倍)。柱狀圖的數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)。統(tǒng)計分析采用ANOVA加Dunnett’s檢驗，*表示與未處理小鼠組(na?ve mouse group)相比，p值小于0.01;#表示與OVA+A20組相比，p值小于0.05。這些數(shù)據(jù)代表了六次獨立實驗的結(jié)果。

圖5. 在本研究中，作者評估了氣道黏膜調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的數(shù)量及其免疫調(diào)節(jié)功能。

從正常小鼠和哮喘小鼠的氣道組織中制備單個細胞，并通過流式細胞儀進行分析。a) 篩選的點圖顯示CD4+ T細胞;b) 篩選的點圖顯示Treg細胞的頻率;c) 條形圖顯示氣道組織中Treg細胞的總結(jié)數(shù)量;d) 在b面板篩選的細胞中，直方圖顯示IL-10+ T細胞;e) 條形圖顯示d面板中總結(jié)的IL-10+ Treg細胞數(shù)量。f, g) 通過流式細胞分選系統(tǒng)(FCSS)，從氣道組織單個細胞中分離出CD4+ CD25+ CD127? Treg細胞;從哮喘小鼠脾臟中分離出CD4+ CD25?效應T細胞和樹突狀細胞(DCs)。效應T細胞用CFSE標記，并與Treg細胞(Treg細胞來源在每個子面板上方顯示)以5×103 : 1×103的比例共培養(yǎng)，每孔在OVA(或BSA)和DCs存在下。三天后，通過流式細胞儀分析細胞。f) 篩選的直方圖顯示增殖效應細胞的頻率。g) 條形圖顯示增殖效應細胞的頻率。條形圖的數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式呈現(xiàn)。統(tǒng)計分析采用ANOVA加Dunnett’s檢驗，*表示與“a”組(b和e)或“d”組(g)相比，p值小于0.01。這些數(shù)據(jù)代表了六次獨立實驗的結(jié)果。

研究結(jié)論

作者克隆并表達了A20蛋白，并在OVA致敏的BALB/c小鼠模型中測試了A20或OVA+A20治療對氣道炎癥的影響。結(jié)果顯示OVA+A20能有效抑制哮喘反應，而單獨A20治療效果有限。利用PLGA納米顆粒作為載體，作者制備了OVA+A20納米疫苗，這些納米顆粒能在96小時內(nèi)完全釋放載荷。納米疫苗在降低哮喘小鼠的血清特異性IgE水平、BALF中的炎癥細胞數(shù)和氣道阻力方面效果顯著。此外，納米疫苗還能增加氣道組織中的IL-10+ Treg細胞生成，這些Treg細胞具有抑制效應T細胞增殖的能力。