乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，有超過2.5億人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我國，人數(shù)接近1億人。NTCP工具細(xì)胞，特別是外源表達(dá)NTCP的肝癌細(xì)胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重現(xiàn)性佳的特點(diǎn)，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演著至關(guān)重要的角色。這些細(xì)胞模型能夠有效模擬HBV的感染過程，為研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒復(fù)制以及藥物篩選提供了一個強(qiáng)大而便捷的體外平臺。它們不僅有助于揭示HBV感染的分子機(jī)制，如DDX3作為宿主限制因子阻礙cccDNA轉(zhuǎn)錄，GPC5作為附著因子在感染入胞過程中的作用，還能通過直接與NTCP相互作用或下調(diào)NTCP表達(dá)來篩選和驗(yàn)證抗病毒藥物的活性，例如環(huán)孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，這些工具細(xì)胞還促進(jìn)了對HBV宿主特異性分子的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)展支持HBV感染的小動物模型提供了可能，這對于乙肝相關(guān)研究和藥物開發(fā)具有重大意義。

基本信息

英文標(biāo)題：Elevated NTCP expression by an iPSC-derived human hepatocyte maintenance medium enhances HBV infection in NTCP-reconstructed HepG2 cells.

中文標(biāo)題：通過人源iPSC來源的肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基提高NTCP重構(gòu)的HepG2細(xì)胞中HBV感染。

發(fā)表期刊：《Cell & Bioscience》

影響因子：6.1

作者單位：

Center for Vaccines and Immunity, The Abigail Wexner Research Institute

at Nationwide Children’s Hospital, Columbus, OH 43205, USA.

作者信息：

Xinlei Li, Zhaohui Xu, Bidisha Mitra, Minghang Wang, Haitao Guo, Zongdi Feng.

研究背景

NTCP是HBV的關(guān)鍵受體，重構(gòu)的HepG2-NTCP肝癌細(xì)胞支持HBV感染但效率不高，未觀察到病毒擴(kuò)散。全球約有2.57億慢性HBV感染者，但現(xiàn)有抗病毒藥物無法根除病毒。HBV是一種有包膜的病毒，含有約3200個核苷酸的松弛環(huán)狀DNA基因組。由于缺乏有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和動物模型，新藥物和治療方法的發(fā)展受限。NTCP表達(dá)在增殖或再生的肝細(xì)胞中難以維持高水平。

研究方法

HepG2-NTCP細(xì)胞在含有10% FBS、1%青霉素和鏈霉素以及8 μg/ml blasticidin的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，而HBV顆粒則從HepDE19細(xì)胞培養(yǎng)上清中收集。在試劑方面，HepG2和HepG2-NTCP細(xì)胞使用TaKaRa Bio USA提供的Hepatocyte maintenance medium (HMM)進(jìn)行預(yù)處理或長期培養(yǎng)，NTCP抗體則由瑞士蘇黎世大學(xué)化學(xué)和應(yīng)用生物科學(xué)系的Bruno Stieger博士提供。在HBV感染實(shí)驗(yàn)中，HepG2或HepG2-NTCP細(xì)胞在接種HBV前24小時用HMM預(yù)處理，感染后更換為HMM或D10/2%DMSO培養(yǎng)基。免疫熒光染色方面，不同時間點(diǎn)感染的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后，經(jīng)過封閉、滲透、特異性一抗和二抗染色、DAPI復(fù)染，并在顯微鏡下觀察。RNA-Seq分析中，HepG2-NTCP細(xì)胞用D10/2%DMSO或HMM預(yù)處理24小時后提取總RNA，去除rRNA后獲得mRNA片段和cDNA，建庫并在Illumina HiSeq 4000平臺上產(chǎn)生6000萬對端讀長150 bp的測序數(shù)據(jù)。最后，使用DAVID程序?qū)Σ町惐磉_(dá)基因進(jìn)行基因本體(GO)分析，并利用KEGG數(shù)據(jù)庫理解高級生物功能和通路。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1. 肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基(HMM)增強(qiáng)了HepG2-NTCP細(xì)胞中的乙型肝炎病毒(HBV)感染。

首先，HepG2-NTCP細(xì)胞用100或500基因組當(dāng)量(GE)/細(xì)胞的HBV在含有4%聚乙二醇8000(PEG8000)的DMEM或HMM中稀釋，并在有無10 μM環(huán)孢素A(CsA)的情況下接種。16小時后，移除接種液，細(xì)胞被洗滌并重新用含有10% FBS和2% DMSO的DMEM(D10/2% DMSO)或HMM培養(yǎng)。接種后10天，細(xì)胞被固定，并使用抗HBc抗體進(jìn)行免疫熒光染色。細(xì)胞核用DAPI染色。其次，HMM在HBV接種前、中或后被加入到HepG2-NTCP細(xì)胞培養(yǎng)中(100 GE/細(xì)胞)。接種后10天(B)或8天(C)，細(xì)胞被固定并用抗HBc抗體染色。比例尺=50 μm。使用NIH的ImageJ軟件對HBV感染區(qū)域進(jìn)行量化，并將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為在常規(guī)培養(yǎng)基(D10/2% DMSO)中用100 GE/細(xì)胞的HBV感染的培養(yǎng)值，并以兩個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差呈現(xiàn)。

圖2. 肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基(HMM)處理誘導(dǎo)異位NTCP表達(dá)。

A. 在D10/2%DMSO培養(yǎng)基或HMM中培養(yǎng)24或72小時后，通過實(shí)時定量PCR(RT-qPCR)檢測HepG2和HepG2-NTCP細(xì)胞中NTCP mRNA水平。未處理的D10培養(yǎng)基不含2% DMSO。

B. 在指定培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48或72小時后，HepG2-NTCP或親本HepG2細(xì)胞中NTCP蛋白表達(dá)的免疫熒光圖像。原代肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基(PMM)含有10% FBS、1%青霉素/鏈霉素、0.17 μM人類胰島素、10 μM氫化可的松21-半琥珀酸鹽和1.8% DMSO。

C. HepG2-NTCP細(xì)胞在接種HBV(500 GE/細(xì)胞)前未感染或用HMM或PMM預(yù)處理16小時，然后在含有4% PEG 8000的PMM中接種HBV 24小時。移除HBV接種液后，細(xì)胞在PMM中維持7天。

D. 在HBV感染后10天，不同HepG2-NTCP克隆中NTCP、HBc(紅色)和HBs(綠色)的表達(dá)。本研究中大多數(shù)實(shí)驗(yàn)使用了克隆12。

E. HepG2-NTCP細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有CMV-IE啟動子或EF1α啟動子控制的GFP編碼質(zhì)粒后，在指定培養(yǎng)基中培養(yǎng)指定時間的GFP表達(dá)。比例尺=50 μm。

圖3. 經(jīng)過HMM處理的HepG2-NTCP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，HMM或D10/2%DMSO培養(yǎng)基(對照組)處理24小時后，共鑒定出2727個差異表達(dá)基因(DEGs)，包括1310個上調(diào)和1417個下調(diào)的DEGs。

與對照組相比，HMM處理組中NTCP的表達(dá)增加了6.4倍。KEGG通路分析顯示，HMM激活的前三條通路包括代謝途徑、神經(jīng)活性配體-受體相互作用以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用。HMM還增強(qiáng)了HepG2-NTCP細(xì)胞中的代謝活動，這通過與成熟肝細(xì)胞功能相關(guān)的KEGG通路得到證實(shí)，包括脂質(zhì)代謝、氨基酸合成和外源物質(zhì)代謝。相比之下，下調(diào)的DEGs最豐富的通路包括酒精中毒、癌癥途徑和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在162個與HBV相關(guān)的基因(KEGG通路hsa05161)中，上調(diào)的基因包括SOS1、SLC10A1(NTCP)、STAT4和FASLG;而下調(diào)的基因有17個，其中TNF、MAP2K6、E2F1和CCNE2下調(diào)最為顯著。值得注意的是，TNF能夠通過破壞病毒衣殼的完整性來抑制HBV復(fù)制，而E2F1或CCNE2的下調(diào)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，這可能有利于HBV復(fù)制。然而，由于HMM對HBcAg和HBsAg表達(dá)的最大效應(yīng)是在HBV接種前添加HMM實(shí)現(xiàn)的，通過NTCP上調(diào)增加HBV進(jìn)入似乎是HMM增強(qiáng)HBV感染的主要機(jī)制。

圖4. HMM與PEG的組合并未導(dǎo)致HepG2-NTCP細(xì)胞中HBV的傳播。

在HBV感染前，HepG2-NTCP細(xì)胞先用HMM或D10/2%DMSO預(yù)處理24小時。接種液移除后，細(xì)胞隨后在HMM或D10/2%DMSO培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)或補(bǔ)充4% PEG8000，培養(yǎng)5或10天。通過使用HBc抗體的免疫熒光測定HBV感染率。比例尺=50 μm。

研究結(jié)論

商業(yè)肝細(xì)胞維持培養(yǎng)基(HMM)在接種乙型肝炎病毒(HBV)前24小時的短期處理能顯著提高HBV對NTCP重構(gòu)的HepG2細(xì)胞的感染效率，這一效果是通過增強(qiáng)CMV啟動子驅(qū)動的NTCP表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。不同克隆的HepG2-NTCP細(xì)胞以及不同批次的HMM均顯示出一致的效果，表明該方法也適用于其他使用CMV啟動子驅(qū)動NTCP重構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。HMM能快速誘導(dǎo)HepG2-NTCP細(xì)胞中NTCP的表達(dá)，但長期培養(yǎng)并不會導(dǎo)致NTCP表達(dá)的進(jìn)一步增加。盡管HMM激活了多種代謝途徑，但其如何增強(qiáng)CMV IE啟動子活性的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究以確定HMM中提高NTCP表達(dá)和HBV感染的活性成分。這項(xiàng)研究提供了一個簡單有效的方法，顯著改善了NTCP重構(gòu)的HepG2細(xì)胞中HBV的感染，為HBV的基礎(chǔ)和抗病毒研究開辟了新途徑。