在生物醫(yī)學研究和藥物開發(fā)領域，生物發(fā)光成像技術因其高信噪比而被廣泛應用于細胞測定和動物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類有限，限制了同時成像多個分子和細胞事件的能力。為了突破這一限制，科學家們開發(fā)了一種新型的ATP非依賴性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經過工程改造以增強蛋白質穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時間的變化可以用來定量腫瘤生長，甚至在少量血清中也能檢測到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲熒光素酶的結合使用，為在完整細胞和活體小鼠中定量TGF-β信號傳導的兩個關鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開發(fā)中擴展了信號轉導的成像能力。NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標記細胞和蛋白質時對樣本的侵入性更小，有助于保持細胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點，使其在生物學和醫(yī)學研究中具有廣泛的應用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報告基因，不僅增強了我們對生物過程的理解和疾病機理的研究，而且在開發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標題：Development and Characterization of a Stable Coxsackievirus A16 Infectious Clone with Nanoluc Reporter Gene.

中文標題：帶有NanoLuc報告基因的柯薩奇病毒A16穩(wěn)定感染克隆的開發(fā)和表征。

發(fā)表期刊：《Frontiers in Microbiology》

影響因子：4.0

作者單位：

1.Shanghai Public Health Clinical Center and Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai, China.

2.Clinical Center for Biotherapy, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai, China.

作者信息：

Rui Yu, Min Wang, Lizhen Liu, Jingjing Yan, Jun Fan, Xiaohong Li, Miaomiao Kang.

研究背景

柯薩奇病毒A16(CA16)是導致兒童手足口病(HFMD)的常見病原體之一，屬于人類腸道病毒A種。目前，尚無針對CA16的特定疫苗和藥物，因此深入了解病毒特性和開發(fā)有效治療方法顯得尤為重要。手足口病主要影響嬰幼兒，通常為輕微且自限性疾病，但嚴重病例可能導致麻痹、心肌炎，甚至死亡。在亞太地區(qū)，CA16是僅次于EV71的HFMD常見病原。目前，只有針對EV71的滅活病毒疫苗上市，而對于包括CA16在內的其他腸道病毒尚無疫苗或藥物。

報告病毒對于病毒學研究和小分子抗病毒藥物的開發(fā)至關重要。盡管已有帶有eGFP報告基因的CA16感染性克隆的報道，但eGFP在腸道病毒中通常不穩(wěn)定，且難以進行高通量分析。NanoLuc熒光素酶(Nluc)作為一種新型熒光素酶，具有體積小、亮度高的特點，更適合高通量篩選。本研究成功構建了兩個CA16感染性克隆(rCA16和rCA16-Nluc)，并對其進行了表征。研究發(fā)現(xiàn)，rCA16-Nluc中的Nluc基因在細胞培養(yǎng)中遺傳穩(wěn)定，且在十代培養(yǎng)后沒有丟失報告基因。通過測量熒光強度，研究顯示rCA16-Nluc的應用簡化了抗病毒藥物和中和抗體的測試，并且完全兼容高通量篩選平臺，表明具有廣闊的應用前景。

研究方法

本研究中，Vero細胞在DMEM中培養(yǎng)，CA16病毒株OP293089被分離。通過提取病毒RNA、反轉錄和PCR擴增構建了CA16感染性克隆(rCA16)和帶有NanoLuc熒光素酶報告基因的克隆(rCA16-Nluc)。病毒mRNA通過體外轉錄生成，并轉染到Vero細胞中。Western blot和免疫熒光測定用于檢測病毒蛋白表達，而病毒滴度和抗病毒效果通過滴度測定和熒光素酶活性測量來評估。細胞活力通過CCK-8分析確定。動物實驗涉及感染小鼠和評估病毒致病性。最后，基于熒光素酶的中和實驗用于評估病毒中和抗體滴度。所有數(shù)據(jù)通過至少三次重復實驗獲得，并使用統(tǒng)計軟件進行分析。

實驗結果

圖1：本研究成功構建并鑒定了完整的CA16感染性克隆rCA16，該克隆被插入含有T7啟動子和錘頭狀核酶的pSVA載體中。

Vero細胞被pCA16和rCA16病毒感染后，觀察到細胞病變效應，并在感染后24小時通過免疫印跡檢測病毒2C蛋白。此外，研究還觀察了pCA16和rCA16病毒在Vero細胞中的形態(tài)和病毒斑，以及使用抗3D抗體和Alexa Flour-488標記的二抗進行免疫熒光染色的結果。最后，通過一步生長曲線分析，發(fā)現(xiàn)pCA16和rCA16病毒在感染后24小時病毒RNA量達到峰值，且兩種病毒的生長曲線無統(tǒng)計學差異。

圖2：一周齡的哺乳小鼠通過腹腔注射接種了105 TCID50的pCA16和rCA16病毒，對照組小鼠則給予等體積的PBS。

研究觀察了不同組小鼠體重的變化、感染后的生存曲線、感染后4天在大腦、心臟、肺和肌肉中的病毒RNA負荷，以及pCA16和rCA16感染引起的腦膜出血、肺泡壁增厚和大腿及心肌破裂等病理變化。統(tǒng)計差異通過t-test確定(*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001;****P < 0.0001)。

圖3：在本研究中，我們構建并鑒定了帶有NanoLuc熒光素酶報告基因的柯薩奇病毒A16(CA16)感染性克隆rCA16-Nluc。

首先，我們將Nluc基因和2A蛋白酶切割位點(AITTL)插入到rCA16感染性克隆中。Vero細胞感染rCA16和rCA16-Nluc后，24小時內觀察到細胞病變效應(CPE)。通過免疫印跡檢測，我們從感染的Vero細胞中檢測到了病毒2C蛋白和β-微管蛋白。此外，我們還觀察了rCA16和rCA16-Nluc病毒在Vero細胞中形成的病毒斑的形態(tài)。感染rCA16和rCA16-Nluc(MOI=1)6小時后，Vero細胞被固定并用抗3D抗體染色，隨后使用Alexa Flour-488標記的二抗進行染色，DAPI用于核染色(綠色為2C蛋白;藍色為核)。最后，我們分析了rCA16和rCA16-Nluc的一步生長曲線和相對發(fā)光強度(RLU)，病毒感染Vero細胞(MOI=0.1)后，在6、12、18、24、30和36小時后收獲用于病毒RNA和RLU測量(實線表示病毒RNA的增長;虛線表示RLU的增長)。

圖4：在本研究中，我們對rCA16-Nluc病毒中Nluc基因的穩(wěn)定性進行了測試。

首先，我們通過一系列傳代(從P0到P10)在Vero細胞中收集了rCA16-Nluc病毒，并測試了每個傳代中的熒光素酶活性和Nluc基因存在情況。接著，我們通過感染不同傳代的rCA16-Nluc病毒到Vero細胞，并測量了感染細胞的發(fā)光量(RLU值)和Nluc基因拷貝數(shù)。此外，我們通過RT-PCR擴增了rCA16-Nluc感染細胞的總RNA，并使用瓊脂糖凝膠分析Nluc基因，結果顯示從P0到P10的PCR產物均顯示相同的預期大小，表明在連續(xù)傳代過程中Nluc基因沒有發(fā)生缺失。最后，通過Sanger測序不同傳代的rCA16-Nluc病毒中的Nluc基因，我們確認了Nluc基因序列在P0到P10之間保持不變，從而證實了rCA16-Nluc病毒的遺傳穩(wěn)定性。這些結果表明，rCA16-Nluc病毒在Vero細胞中連續(xù)傳代后，Nluc基因的插入是穩(wěn)定的。

圖5：本研究對GuHCl、利巴韋林、氯喹和NH4Cl四種藥物基于rCA16-Nluc病毒進行了抗病毒效果測試。

Vero細胞在96孔板中過夜培養(yǎng)后，接種rCA16-Nluc病毒(MOI=0.1)，并進行藥物處理。24小時后測量相對發(fā)光強度(RLU)。細胞活力通過CCK-8實驗測定。實驗結果包括不同濃度下藥物的發(fā)光量、計算出的抑制率和細胞活力。具體來說，A、B組展示了GuHCl的發(fā)光量、抑制率和細胞活力;C、D組展示了利巴韋林的相應數(shù)據(jù);E、F組展示了氯喹的相應數(shù)據(jù);G、H組展示了NH4Cl的相應數(shù)據(jù)。統(tǒng)計差異通過t-test確定(*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001;****P < 0.0001)。

圖6：本研究中，我們通過基于rCA16-Nluc的發(fā)光檢測方法對柯薩奇病毒A16(CA16)中和抗體進行了測試。

首先，我們?yōu)樾∈笾贫嗣庖叱绦?，并分析了小鼠中的中和抗體(圖6A)。接著，我們比較了傳統(tǒng)的基于細胞病變效應(CPE-Nab)的中和抗體測試與基于熒光素酶的中和抗體測試(RLU-Nab)之間的相關性(圖6B)。最后，我們測定了初次免疫后第二周和第四周小鼠血清中的中和抗體滴度(圖6C)。統(tǒng)計差異通過t-test確定(*P < 0.05;**P < 0.01;***P < 0.001;****P < 0.0001)。

研究結論

本研究構建了CA16感染性克隆rCA16，并驗證了其在Vero細胞中復制能力和毒力。rCA16-Nluc克隆成功表達NanoLuc熒光素酶，用于病毒復制和藥物篩選。在小鼠模型中，rCA16顯示出高致病性。rCA16-Nluc的穩(wěn)定性在細胞傳代中得到保持，適用于抗病毒藥物和中和抗體的高通量篩選。