熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)是一種基于熒光素酶催化底物氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物發(fā)光的檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)研究。其中，螢火蟲(chóng)熒光素酶(firefly luciferase, Fluc)因其高靈敏度、寬線性檢測(cè)范圍(約7~8個(gè)數(shù)量級(jí))以及較短的半衰期(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中約為3小時(shí)，在植物細(xì)胞中約為3.5小時(shí))而成為最常用的報(bào)告基因。其發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度在酶濃度為10?1? mol/L至10?? mol/L的范圍內(nèi)與酶活性呈線性關(guān)系，并且在理想條件下可檢測(cè)到低至10?2? mol/L的熒光素酶活性。此外，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)具有非放射性、檢測(cè)快速、靈敏度高(比氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT高100倍)等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于高通量篩選和活細(xì)胞檢測(cè)。通過(guò)將熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞后，可利用熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)靈敏且便捷地監(jiān)測(cè)基因表達(dá)水平，已成為細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要工具。

基本信息

英文標(biāo)題：Breast Cancer Cell Colonization ofthe Human Bone Marrow AdiposeTissue Niche

中文標(biāo)題：乳腺癌細(xì)胞定植于人類骨髓脂肪組織微環(huán)境

發(fā)表期刊：《Neoplasia》

影響因子：4.8

作者單位：

1.Department of Pediatrics, 150E Clark Center, 318 Campus Drive, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA 94305-5427

2.EMD Millipore Corporation, 14 Research Park Drive, St Charles, MO 63304-5618

3.Department of Immunology, Fairchild Science Building, D033, 299 Campus Drive, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA 94305-5124

作者信息：

Zach S. Templeton, Wen-Rong Lie, Weigi Wang, Yael Rosenberg-Hasson, Rajiv V. Alluri

研究背景

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一，骨轉(zhuǎn)移相關(guān)事件嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。骨作為乳腺癌的首選轉(zhuǎn)移部位，表明骨組織可能存在特定的組織學(xué)特征，吸引并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，深入研究乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，尋找可靠的診斷手段和早期有效的治療方法具有重要意義。

研究方法

本研究使用了來(lái)自14名接受全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)患者的股骨頭樣本，分離出松質(zhì)骨組織碎片，用于研究乳腺癌細(xì)胞的遷移和定植模式。實(shí)驗(yàn)中使用了MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，這些細(xì)胞系被改造以穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶和綠色熒光蛋白。通過(guò)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，測(cè)量了乳腺癌細(xì)胞向骨組織條件培養(yǎng)基的遷移能力，并利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行分析。同時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡和免疫組化方法評(píng)估了乳腺癌細(xì)胞在骨組織中的定植模式。此外，還對(duì)骨組織培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子、趨化因子和脂肪因子進(jìn)行了多重免疫分析，以探索與乳腺癌細(xì)胞遷移相關(guān)的分泌因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞的遷移與脂肪因子如瘦素(leptin)和白介素-1β(IL-1β)的水平顯著相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：骨髓脂肪組織是成熟人類骨微環(huán)境的重要組成部分

本研究通過(guò)手術(shù)切除的股骨頭樣本，展示了成熟人類骨微環(huán)境中脂肪組織的顯著存在及其在體外模型中的可研究性。股骨頭手術(shù)樣本中分離出的松質(zhì)骨組織碎片顯示出黃色和紅色骨髓含量的差異。組織學(xué)切片顯示，骨髓腔內(nèi)存在大量脂肪細(xì)胞“空泡”，緊鄰礦化的骨小梁。熒光成像揭示了被Osteosense 680標(biāo)記的礦化骨小梁周圍環(huán)繞著脂肪細(xì)胞。此外，培養(yǎng)的骨組織碎片釋放出脂肪微粒，并且可以從骨髓中分離出脂肪細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。這些結(jié)果表明，脂肪組織是骨微環(huán)境的重要組成部分，且可在體外模型中進(jìn)行研究。

圖2：乳腺癌細(xì)胞在骨髓腔定植過(guò)程中與脂肪細(xì)胞建立直接接觸

在與人類松質(zhì)骨組織碎片共培養(yǎng)過(guò)程中，乳腺癌細(xì)胞(如MCF-7-fLuc-EGFP細(xì)胞)在骨髓腔定植時(shí)與脂肪細(xì)胞建立了直接接觸。熒光成像和免疫組化染色顯示，乳腺癌細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)即可與脂肪細(xì)胞直接接觸，并在脂肪細(xì)胞周圍定植。共聚焦顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象，表明乳腺癌細(xì)胞在骨髓腔內(nèi)定植過(guò)程中與脂肪細(xì)胞存在密切的相互作用。

圖3：乳腺癌細(xì)胞通過(guò)微孔膜向人類骨組織碎片遷移

在實(shí)驗(yàn)中，研究人員設(shè)計(jì)了一種非傳統(tǒng)的“反向”遷移實(shí)驗(yàn)，將DA-MB-231-fLuc-EGFP細(xì)胞接種在帶有8微米孔徑的插入物的下表面，觀察這些細(xì)胞是否能夠通過(guò)微孔遷移并定植到骨組織碎片或?qū)φ战M的玻璃珠上。結(jié)果顯示，在24小時(shí)后，骨組織碎片比玻璃珠更頻繁地被乳腺癌細(xì)胞定植，且生物發(fā)光成像(BLI)能夠檢測(cè)到乳腺癌細(xì)胞在骨組織碎片上的定植，但在玻璃珠上未檢測(cè)到信號(hào)。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了14次，每次實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)骨組織碎片和3個(gè)玻璃珠，結(jié)果表明，有生物發(fā)光信號(hào)的骨組織碎片數(shù)量(15/42)顯著多于玻璃珠(3/42)，P值為0.003，這表明乳腺癌細(xì)胞更傾向于向骨組織遷移。

圖4：乳腺癌細(xì)胞向人類骨組織條件培養(yǎng)基遷移

本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)遷移實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將MDA-MB-231-fLuc-EGFP細(xì)胞接種在帶有8微米孔徑的插入物上表面，觀察細(xì)胞是否能夠通過(guò)微孔遷移至含有骨組織培養(yǎng)上清液的接收孔中。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)20小時(shí)遷移后，MDA-MB-231-fLuc-EGFP細(xì)胞顯著遷移到含有骨組織培養(yǎng)上清液的孔中，與對(duì)照培養(yǎng)基(DMEM-10% FBS)相比，遷移能力顯著增強(qiáng)(P < 0.01)。此外，實(shí)驗(yàn)還比較了四種乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231-fLuc-EGFP、SKBR3-fLuc-EGFP、MCF-10A-fLuc-EGFP和MCF-7-fLuc-EGFP)向骨組織培養(yǎng)上清液的遷移能力，發(fā)現(xiàn)只有MDA-MB-231-fLuc-EGFP細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的遷移增強(qiáng)，而其他三種細(xì)胞系未觀察到類似現(xiàn)象。這表明MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)骨組織條件培養(yǎng)基具有更強(qiáng)的趨化性。

圖5：MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞在骨組織條件培養(yǎng)基中的遷移能力增強(qiáng)

本研究通過(guò)14個(gè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(THR)樣本的骨組織培養(yǎng)上清液，檢測(cè)了MDA-MB-231-fLuc-EGFP乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照培養(yǎng)基相比，MDA-MB-231-fLuc-EGFP細(xì)胞向骨組織條件培養(yǎng)基的遷移能力顯著增強(qiáng)(P = 0.0014)。具體而言，骨組織條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的遷移能力平均增加了約2.5倍。這一結(jié)果表明，骨組織分泌的因子能夠顯著促進(jìn)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的遷移，從而可能促進(jìn)其在骨微環(huán)境中的定植。

圖6：MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞遷移與骨組織條件培養(yǎng)基中特定因子相關(guān)

本研究通過(guò)13個(gè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)(THR)樣本的骨組織條件培養(yǎng)基，分析了MDA-MB-231-fLuc-EGFP乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞的遷移能力與培養(yǎng)基中瘦素(leptin)和白介素-1β(IL-1β)的水平顯著相關(guān)。具體而言，散點(diǎn)圖展示了乳腺癌細(xì)胞遷移能力與瘦素、IL-1β、OPG、OPN和IL-6水平的關(guān)系。通過(guò)回歸分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞遷移能力與瘦素和IL-1β水平呈正相關(guān)(P值均顯著)，而與其他因子(如OPG、OPN和IL-6)的相關(guān)性不顯著。

研究結(jié)論

本研究通過(guò)14個(gè)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)樣本的松質(zhì)骨組織碎片，發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞(如MDA-MB-231和MCF-7)在共培養(yǎng)過(guò)程中能夠廣泛侵入骨髓腔，并與脂肪細(xì)胞建立直接接觸，顯示出對(duì)脂肪細(xì)胞的偏好性遷移。實(shí)驗(yàn)中，MDA-MB-231-fLuc-EGFP細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的骨趨向性，能夠通過(guò)微孔膜遷移到骨組織碎片上，并在11/14的樣本中成功定植，遷移能力顯著高于對(duì)照組(P = 0.003)。此外，MDA-MB-231細(xì)胞向骨組織條件培養(yǎng)基的遷移能力顯著高于對(duì)照培養(yǎng)基(P = 0.0014)，且與培養(yǎng)基中瘦素(leptin)和白介素-1β(IL-1β)水平顯著相關(guān)(P < 0.0001)。這些結(jié)果表明，骨髓脂肪組織及其分泌的瘦素和IL-1β在乳腺癌細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。