同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(xué)(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問題，研究人員通過將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達(dá)到同源異體腫瘤細(xì)胞中，開發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細(xì)胞系更慢的腫瘤生長速度，這可能是由于免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達(dá)的模型對ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們在增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，研究人員驗(yàn)證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細(xì)胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細(xì)胞不僅增強(qiáng)了對ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標(biāo)題：Computer-Aided Discovery of Potent Broad-Spectrum Vaccine Adjuvants

中文標(biāo)題：計(jì)算機(jī)輔助發(fā)現(xiàn)強(qiáng)效廣譜疫苗佐劑

發(fā)表期刊：《Angewandte Chemie International Edition》

影響因子：16.6

作者單位：

1.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco - Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085 (P. R. China).

2.School of Environmental Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 (P. R. China).

3.Institute of Environmental Research at Greater Bays, Key Laboratory for Water Quality and Conservation of the Pearl River Delta, Ministry of Education, Guangzhou University, Guangzhou 510006 (P. R. China).

作者信息：Juan Ma、Shenging Wang、Chuanfang Zhao

研究背景

當(dāng)前疫苗佐劑(如鋁鹽和油水乳劑)雖安全性良好，但存在免疫反應(yīng)范圍窄、持續(xù)時(shí)間短等問題。新型佐劑(如MF59、AS01等)因靶向單一模式識別受體(PRR)或引發(fā)不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限。此外，重組蛋白疫苗抗原免疫原性較低，現(xiàn)有佐劑難以激發(fā)廣譜持久的T/B細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致新冠等疫苗需多次加強(qiáng)接種。針對這些挑戰(zhàn)，研究提出利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)，開發(fā)靶向多種Toll樣受體(TLR)的納米佐劑，通過協(xié)同激活樹突狀細(xì)胞(DC)增強(qiáng)疫苗效果，為癌癥免疫治療和傳染病防控提供新策略。

研究方法

研究通過分子對接和機(jī)器學(xué)習(xí)分析TLR激動劑的關(guān)鍵結(jié)合特征(如疏水作用、氫鍵和π鍵)，設(shè)計(jì)并合成了46種含芳香基團(tuán)和氫鍵供體的TLR配體，并將其組裝于5 nm金納米顆粒(AuNP)表面。利用透射電鏡、流式細(xì)胞術(shù)、ELISpot等技術(shù)，評估AuNP佐劑對骨髓源性樹突狀細(xì)胞(BMDC)的激活能力(如細(xì)胞因子分泌、表面標(biāo)志物表達(dá))。通過定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)模型和隨機(jī)森林算法，解析納米顆粒-配體復(fù)合物的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征。最終在B16-OVA黑色素瘤和4T1-PD1乳腺癌小鼠模型中驗(yàn)證佐劑的抗腫瘤效果及免疫機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的金納米顆粒(AuNP)佐劑

a)示意圖顯示了通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)從疏水相互作用、氫鍵和π-鍵與Toll樣受體(TLR)結(jié)合獲得的TLR激動劑配體(左側(cè))。配體呈現(xiàn)在金納米顆粒表面形成AuNP佐劑(中間)，靶向細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)TLR(右側(cè))。

b)各種TLR的晶體結(jié)構(gòu)以及與TLR激動劑配體結(jié)合的極性(粉色)、芳香性(橙色)、疏水性(藍(lán)色)、陽離子(紫色)和陰離子(綠色)殘基。

圖2：金納米顆粒(AuNP)佐劑庫的合成與篩選，用于激活骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(BMDCs)a) TLR激動劑配體由L-賴氨酸連接子和多樣的R1和R2基團(tuán)組成，通過強(qiáng)的金-硫鍵連接到金納米顆粒表面(左側(cè))。所得的AuNP佐劑被測試其在BMDCs中促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)激活的能力(右側(cè))。b) 包含46種成員的TLR激動劑配體庫含有多種R1和R2功能基團(tuán)。c) 熱圖顯示了在2.5 μg/mL濃度下，AuNP1-46處理24小時(shí)后，BMDCs中細(xì)胞因子基因表達(dá)(c)和表面標(biāo)志物表達(dá)d)的平均倍數(shù)變化，相對于未處理的空白對照(n=4)。未處理的空白對照：未用AuNP處理的BMDCs，僅添加了等體積的溶劑溶液(pgs)。普通AuNPs：表面包覆檸檬酸但未連接分子配體。

圖3：展示了AuNP27和AuNP35通過其表面配體的結(jié)構(gòu)特征(如苯環(huán)和四氫呋喃)以TLR依賴的方式促進(jìn)BMDCs的激活，表現(xiàn)為增加IL-12、TNF-α的產(chǎn)生以及CD86和MHC-II的表達(dá)。

通過機(jī)器學(xué)習(xí)分析納米描述符，揭示了這些納米顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)(如尺寸、zeta電位)與BMDC反應(yīng)(如細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子表達(dá))之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AuNP27和AuNP35顯著增加了BMDCs中激活標(biāo)志物的表達(dá)，且這種激活作用可通過TLR拮抗劑抑制，表明其激活依賴于TLR信號通路。此外，配體27和配體35與TLR4-MD2復(fù)合物的結(jié)合模式分析進(jìn)一步揭示了其作用機(jī)制。這些結(jié)果來自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，具有良好的重復(fù)性。

圖4：展示了AuNP27和AuNP35在增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DC)抗原呈遞和遷移至淋巴結(jié)(LN)方面的作用。

在體外實(shí)驗(yàn)中，AuNP佐劑顯著增強(qiáng)了DC的抗原呈遞能力，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，它們促進(jìn)了BMDCs向淋巴結(jié)的遷移。透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示，經(jīng)AuNP27或AuNP35預(yù)處理的BMDCs能夠與OT.I小鼠來源的CD4+ T細(xì)胞形成免疫突觸。此外，AuNP處理的BMDCs在MHC-II呈遞OVA復(fù)合物方面表現(xiàn)出更高的效率，并且在與脾細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)了更多的TNF-α分泌斑點(diǎn)，表明其增強(qiáng)了T細(xì)胞的激活。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，AuNP35顯著促進(jìn)了BMDCs向淋巴結(jié)的遷移，且遷移細(xì)胞的比例在注射后顯著增加。這些結(jié)果表明AuNP27和AuNP35作為佐劑能夠有效增強(qiáng)DC的抗原呈遞和遷移能力，從而促進(jìn)免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

圖5：研究了金納米顆粒(AuNP)佐劑在淋巴結(jié)(LN)中與樹突狀細(xì)胞(DC)的相互作用及其分布

研究通過多種方法評估了AuNP在淋巴結(jié)中的分布及其引起的細(xì)胞反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)小鼠在腹腔注射AuNP27或AuNP35后，H&E染色顯示AuNP在淋巴結(jié)中沉積但未引起組織損傷。激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜(LA-ICP-MS)分析顯示，Au在淋巴結(jié)中的分布呈現(xiàn)聚集或積累的高信號峰。透射電子顯微鏡(TEM)和共聚焦顯微鏡圖像進(jìn)一步確認(rèn)了AuNP在淋巴結(jié)中的存在，并顯示其與CD11c+ DC細(xì)胞的鄰近分布。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，AuNP處理的小鼠淋巴結(jié)中，DC細(xì)胞的CD40和CD83表達(dá)顯著增加，表明AuNP佐劑增強(qiáng)了DC的成熟和激活。此外，免疫組化染色顯示，AuNP處理的小鼠淋巴結(jié)中CD11c+細(xì)胞的比例顯著增加。這些結(jié)果表明AuNP佐劑能夠有效進(jìn)入淋巴結(jié)并與DC相互作用，增強(qiáng)其成熟和激活，從而促進(jìn)免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

圖6：研究了AuNP27和AuNP35在增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DC)介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中的作用

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：C57BL/6N小鼠在腫瘤細(xì)胞注射前的第52天、47天、42天和34天，通過尾部皮下注射自由OVA抗原、AuNP27@抗原或AuNP35@抗原進(jìn)行免疫。結(jié)果顯示，在免疫后的第0天，AuNP處理的小鼠脾臟中樹突狀細(xì)胞(DCs)的成熟標(biāo)志物(CD11c、CD83和CD40)表達(dá)顯著增加，表明AuNP佐劑增強(qiáng)了DC的成熟和激活。此外，AuNP處理的小鼠脾細(xì)胞中特異性CD8+ T細(xì)胞的百分比和數(shù)量顯著增加，且這些T細(xì)胞在重新刺激后表現(xiàn)出更高的TNF-α分泌能力。流式細(xì)胞術(shù)分析還顯示，AuNP處理的小鼠淋巴結(jié)和脾臟中T細(xì)胞亞群的比例顯著增加。在腫瘤挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)中，AuNP35@抗原免疫的小鼠肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量最少，表明其具有更強(qiáng)的抗腫瘤效果。這些結(jié)果表明，AuNP27和AuNP35通過激活DC并促進(jìn)抗原呈遞給T細(xì)胞，有效增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自每組6只生物學(xué)獨(dú)立的小鼠，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究結(jié)論

本研究通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)，篩選出兩種新型廣譜疫苗佐劑(AuNP27和AuNP35)，它們能夠通過靶向多種Toll樣受體(TLR)顯著激活樹突狀細(xì)胞(DC)，增強(qiáng)其抗原呈遞能力和T細(xì)胞激活效率，并促進(jìn)DC向淋巴結(jié)的遷移。在B16-OVA黑色素瘤和4T1-PD1乳腺癌小鼠模型中，AuNP27和AuNP35與腫瘤特異性抗原聯(lián)合使用時(shí)，顯著抑制了腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫反應(yīng)。這些結(jié)果表明，AuNP27和AuNP35作為一種新型納米佐劑，具有強(qiáng)大的免疫激活能力，可廣泛應(yīng)用于疫苗開發(fā)，尤其是在癌癥免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。