乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，有超過(guò)2.5億人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我國(guó)，人數(shù)接近1億人。NTCP工具細(xì)胞，特別是外源表達(dá)NTCP的肝癌細(xì)胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重現(xiàn)性佳的特點(diǎn)，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演著至關(guān)重要的角色。這些細(xì)胞模型能夠有效模擬HBV的感染過(guò)程，為研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒復(fù)制以及藥物篩選提供了一個(gè)強(qiáng)大而便捷的體外平臺(tái)。它們不僅有助于揭示HBV感染的分子機(jī)制，如DDX3作為宿主限制因子阻礙cccDNA轉(zhuǎn)錄，GPC5作為附著因子在感染入胞過(guò)程中的作用，還能通過(guò)直接與NTCP相互作用或下調(diào)NTCP表達(dá)來(lái)篩選和驗(yàn)證抗病毒藥物的活性，例如環(huán)孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，這些工具細(xì)胞還促進(jìn)了對(duì)HBV宿主特異性分子的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)展支持HBV感染的小動(dòng)物模型提供了可能，這對(duì)于乙肝相關(guān)研究和藥物開發(fā)具有重大意義。

基本信息

英文標(biāo)題：Hepatitis C Virus Infection Cycle-Specific MicroRNA Profiling Reveals Stage-Specific miR-4423-3p Targets RIG-I to Facilitate Infection

中文標(biāo)題：丙型肝炎病毒(HCV)感染周期特異性微RNA分析揭示階段特異性miR-4423-3p靶向RIG-I以促進(jìn)感染

發(fā)表期刊：《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》

影響因子：6.1

作者單位：

1.Department of Microbiology, Faculty of Naval Medicine, Naval Medical University, Shanghai, China

2.Spine Center, Department of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital Affiliated to Naval Medical University, Shanghai, China

作者信息：

Xijing Qian,Bingan Wu,Chen Xu

研究背景

丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球慢性肝病的主要原因之一，涉及多種病理過(guò)程和宿主因素，包括非編碼小RNA。盡管已有研究報(bào)道了一些與HCV感染相關(guān)的基因，但潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不明確。本研究通過(guò)小RNA測(cè)序，明確了HCV感染的Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞中miRNA的表達(dá)譜，鑒定了在HCV生命周期不同階段表達(dá)失調(diào)的miRNA，揭示了miRNA在HCV感染和進(jìn)展中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為疾病的新治療和診斷靶點(diǎn)提供了新的視角。

研究方法

本研究使用Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞進(jìn)行HCVcc(JFH-1基因組)感染實(shí)驗(yàn)，通過(guò)免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)感染效果。在感染后不同時(shí)間點(diǎn)提取總RNA，構(gòu)建小RNA cDNA文庫(kù)，并利用Illumina HiSeq? 2500測(cè)序儀進(jìn)行高通量小RNA測(cè)序。同時(shí)，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCV核心蛋白，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)病毒RNA水平。此外，還合成了miR-4423-3p的模擬物和抑制劑，并使用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，研究其功能。HCV假病毒顆粒(HCVpp)通過(guò)HEK 293T細(xì)胞生成，用于評(píng)估HCV進(jìn)入效率。最后，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-4423-3p與RIG-I或IFN-g的3’UTR的相互作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：展示了HCV感染過(guò)程中miRNA的表達(dá)譜，通過(guò)層次聚類分析和主成分分析，揭示了不同感染階段和不同細(xì)胞系之間的miRNA表達(dá)差異。

圖2：展示了HCV感染的Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞中miRNA的表達(dá)差異，通過(guò)Venn圖和qPCR驗(yàn)證了38個(gè)重疊的miRNA，其中6個(gè)miRNA在兩個(gè)細(xì)胞系中表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖3：展示了HCV感染過(guò)程中不同階段(進(jìn)入、復(fù)制和傳播)的miRNA表達(dá)變化，揭示了各階段特異性的miRNA。

圖4：展示了Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞中與RIG-I/IFN途徑相關(guān)的miRNA，通過(guò)miRanda算法預(yù)測(cè)miR-4423-3p可能與RIG-I或IFN-g mRNA結(jié)合。

圖5：展示了miR-4423-3p對(duì)HCV感染的影響，包括miR-4423-3p模擬物和抑制劑對(duì)HCV感染的影響，以及miR-4423-3p對(duì)HCV進(jìn)入、復(fù)制和組裝的影響。

圖6：展示了miR-4423-3p對(duì)RIG-I及其下游因子表達(dá)的影響，通過(guò)RT-qPCR和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-4423-3p對(duì)RIG-I的調(diào)控作用。

研究結(jié)論

本研究通過(guò)高通量測(cè)序分析了HCV感染過(guò)程中不同階段的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)6個(gè)miRNA在Huh7和Huh7.5.1細(xì)胞中表達(dá)趨勢(shì)一致，32個(gè)miRNA在感染過(guò)程中表達(dá)失調(diào)。其中，miR-4423-3p通過(guò)直接結(jié)合RIG-I mRNA，抑制RIG-I/IFN途徑，顯著促進(jìn)HCV感染。miR-4423-3p的過(guò)表達(dá)增加了HCV核心蛋白和病毒RNA水平，而其抑制則減少了病毒蛋白和RNA水平。此外，miR-4423-3p通過(guò)抑制RIG-I及其下游因子(MAVS、TRAF3、TBK1和IRF-3)的表達(dá)，抑制了宿主的抗病毒反應(yīng)。本研究揭示了HCV感染周期中不同階段特異性的miRNA，為理解HCV感染的分子機(jī)制提供了新的見解，并為開發(fā)新的診斷和治療靶點(diǎn)提供了潛在的分子證據(jù)。