Fluc細(xì)胞是經(jīng)過(guò)基因工程改造后能夠表達(dá)螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞，因其高靈敏度、低背景干擾、蛋白穩(wěn)定性強(qiáng)和耐熱性而在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)中被廣泛應(yīng)用。這些細(xì)胞不僅能夠用于驗(yàn)證miRNA與mRNA、lncRNA、circRNA之間的相互作用，還能動(dòng)態(tài)監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，以及研究CAR-T細(xì)胞治療的效果。Fluc細(xì)胞的高靈敏度和穩(wěn)定性減少了對(duì)樣本的侵入性，保持了細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)，而其快速反應(yīng)和低背景發(fā)光特性，預(yù)示著在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)luc細(xì)胞的應(yīng)用將進(jìn)一步擴(kuò)展，為疾病研究和治療提供更多可能性。

基本信息

英文標(biāo)題：Mannosylated-serum albumin nanoparticle imaging to monitor tumor-associated macrophages under anti-PD1 treatment.

中文標(biāo)題：甘露糖化血清白蛋白納米顆粒成像監(jiān)測(cè)抗PD-1治療下的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。

發(fā)表期刊：《Journal of Nanobiotechnology》

影響因子：10.6

作者單位：

1.Institute of Endemic Disease, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea.

2.Department of Nuclear Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Republic of Korea.

作者信息：

Gyo Jeong Gu, Hyewon Chung, Ji Yong Park, Ranji Yoo, Hyung?Jun Im, Hongyoon Choi.

研究背景

免疫檢查點(diǎn)抑制劑，例如針對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)的抗體，能夠通過(guò)重新激活免疫系統(tǒng)來(lái)阻止腫瘤生長(zhǎng)。然而，僅通過(guò)腫瘤大小的變化來(lái)確定它們的療效可能不準(zhǔn)確。由于腫瘤微環(huán)境(TME)中的免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞，與對(duì)抗PD-1治療的反應(yīng)相關(guān)，因此使用納米顆粒對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)進(jìn)行成像可以無(wú)創(chuàng)地提供TME的免疫富集狀態(tài)。在此，甘露糖化血清白蛋白(MSA)納米顆粒被用放射性同位素68Ga標(biāo)記，以靶向巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體，根據(jù)抗PD-1療法對(duì)TME進(jìn)行無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。

研究方法

在本研究中，作者利用7-10周齡的C57BL/6雌性小鼠建立了B16F10-Luc黑色素瘤和MC38-Luc結(jié)直腸腺癌模型，通過(guò)腹腔注射抗PD-1抗體進(jìn)行治療。研究包括了腫瘤體積測(cè)量、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)和定量PCR分析。此外，作者合成了[68Ga]Ga-MSA用于PET成像，以評(píng)估腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的活性。數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism軟件，通過(guò)t檢驗(yàn)和ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：[68Ga]Ga-MSA納米顆粒成像在監(jiān)測(cè)腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的示意圖。

圖2：“抗PD-1治療應(yīng)答者中CD8+ T細(xì)胞頻率和活性的增強(qiáng)”。

在接受抗PD-1治療的應(yīng)答者中，CD8+ T細(xì)胞的頻率和活性增加。攜帶B16F10-Luc腫瘤的小鼠在第10天、第14天和第18天接受了100微克的抗PD-1治療。在開始抗PD-1治療后15天獲取腫瘤。a圖顯示了抗PD-1治療后B16F10-Luc腫瘤攜帶小鼠(非應(yīng)答者，n=8;應(yīng)答者，n=6)的平均腫瘤體積和個(gè)體腫瘤體積。b圖通過(guò)評(píng)估腫瘤接種后第18天至第25天之間腫瘤生長(zhǎng)的百分比來(lái)評(píng)估響應(yīng)(非應(yīng)答者，n=8;應(yīng)答者，n=6)。c圖顯示了抗PD-1治療后腫瘤的重量(非應(yīng)答者，n=8;應(yīng)答者，n=6)。d圖展示了通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞的頻率(以CD45+CD3+CD8+群體為門控)(n=6/組)。e圖通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了腫瘤浸潤(rùn)性CD8+ T細(xì)胞中Granzyme B+和IFNγ+的百分比(n=6/組)。f圖展示了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中Cxcl9和Cxcl10 mRNA表達(dá)的相對(duì)水平(n=6/組)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)呈現(xiàn)。使用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。數(shù)據(jù)顯示了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。*p < 0.05;**p < 0.01;****p < 0.0001。

圖3：抗PD-1治療應(yīng)答者中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞頻率的增加。

在接受抗PD-1治療的應(yīng)答者中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的頻率有所增加。在抗PD-1治療后第15天，研究比較了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中的CD45+和CD45-細(xì)胞百分比(非應(yīng)答者，n=6;應(yīng)答者，n=5)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量了腫瘤微環(huán)境中主要免疫細(xì)胞類型的頻率(非應(yīng)答者，n=6;應(yīng)答者，n=5)。還測(cè)定了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中Ccl2和Ccl5 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(每組n=3)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)呈現(xiàn)。使用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性，對(duì)于多重比較，執(zhí)行了ANOVA和Tukey的后續(xù)測(cè)試。數(shù)據(jù)顯示了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001。

圖4：抗PD-1治療應(yīng)答者與非應(yīng)答者中[68Ga]Ga-MSA納米顆粒成像模式的差異。

本研究探討了抗PD-1治療應(yīng)答者與非應(yīng)答者中[68Ga]Ga-MSA納米顆粒的不同成像模式。a圖提供了MSA的示意圖。b圖通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中CD206+細(xì)胞的頻率(每組n=4)。c圖量化了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤組織中CD206免疫組化染色的結(jié)果。d圖展示了根據(jù)抗PD-1治療反應(yīng)的B16F10-Luc腫瘤攜帶小鼠的代表性PET成像概覽。冠狀全身PET圖像下方的面板是腫瘤的裁剪矢狀面。e圖在抗PD-1治療后第15天測(cè)量了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中的病灶與血池(LBP)比率(非應(yīng)答者，n=14;應(yīng)答者，n=10)。f圖展示了代表性的流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)圖(左)以及通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定的MSA+細(xì)胞百分比(右)(非應(yīng)答者，n=9;應(yīng)答者，n=7)。g圖顯示了在抗PD-1治療早期階段(第15天)通過(guò)LBP測(cè)量的[68Ga]Ga-MSA攝取與晚期(第24天)腫瘤體積的負(fù)相關(guān)性(非應(yīng)答者，n=14;應(yīng)答者，n=10)。上圖的比例尺為1毫米，放大圖為300微米。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)呈現(xiàn)。使用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001。

圖5：抗PD-1治療后MC38-Luc腫瘤小鼠模型中[68Ga]Ga-MSA納米顆粒成像模式的差異。

在MC38-Luc腫瘤小鼠模型中，對(duì)抗PD-1治療有反應(yīng)和無(wú)反應(yīng)的小鼠展現(xiàn)出不同的[68Ga]Ga-MSA納米顆粒成像模式。這些小鼠在第7天、第10天和第13天接受了100微克的抗PD-1治療，實(shí)驗(yàn)在抗PD-1治療開始后15天進(jìn)行。a圖顯示了接受抗PD-1治療的小鼠(非應(yīng)答者，n=5;應(yīng)答者，n=4)的MC38-Luc腫瘤體積。b圖通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中CD206+細(xì)胞的頻率(非應(yīng)答者，n=5;應(yīng)答者，n=4)。c圖提供了對(duì)抗PD-1治療有反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)的MC38-Luc腫瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)代表性PET成像概覽。d圖在抗PD-1治療后第22天測(cè)量了非應(yīng)答者和應(yīng)答者腫瘤中的病灶與血池(LBP)比率(非應(yīng)答者，n=5;應(yīng)答者，n=4)。這些結(jié)果來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的相似發(fā)現(xiàn)。*p < 0.05;**p < 0.01;***p < 0.001;****p < 0.0001。

圖6：腫瘤外植體上清液誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞功能重塑。

本研究探討了腫瘤外植體上清液(TES)對(duì)巨噬細(xì)胞功能重塑的影響。a圖提供了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。b圖展示了非應(yīng)答者和應(yīng)答者來(lái)源的TES處理24小時(shí)后，骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDMs)中Cxcl9、Cxcl10、iNos、IL-1β和TNFα mRNA表達(dá)的相對(duì)水平(每組n=3)。數(shù)據(jù)顯示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)，并通過(guò)雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。這些數(shù)據(jù)代表了在三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。*p < 0.05;**p < 0.01。

研究結(jié)論

研究結(jié)論表明，在B16F10-Luc和MC38-Luc腫瘤小鼠模型中，對(duì)抗PD-1治療有反應(yīng)的小鼠顯示出腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和淋巴細(xì)胞比例的增加，且TAMs是腫瘤微環(huán)境(TME)中最豐富的免疫細(xì)胞群體。通過(guò)非侵入性的[68Ga]Ga-MSA正電子發(fā)射斷層掃描(PET)成像技術(shù)，研究者觀察到在抗PD-1治療早期階段，應(yīng)答者小鼠的TAMs數(shù)量增加。這一發(fā)現(xiàn)表明，使用MSA納米顆粒對(duì)TAMs進(jìn)行非侵入性成像可以反映與抗PD-1反應(yīng)密切相關(guān)的TME中免疫細(xì)胞的富集狀態(tài)，這種方法有潛力用于監(jiān)測(cè)和評(píng)估免疫檢查點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤反應(yīng)。