同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(xué)(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問題，研究人員通過將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達(dá)到同源異體腫瘤細(xì)胞中，開發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細(xì)胞系更慢的腫瘤生長速度，這可能是由于免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達(dá)的模型對(duì)ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們?cè)谠鰪?qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，研究人員驗(yàn)證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細(xì)胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細(xì)胞不僅增強(qiáng)了對(duì)ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評(píng)估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對(duì)于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標(biāo)題：A Potent Micron Neoantigen Tumor Vaccine GP-Neoantigen Induces Robust Antitumor Activity in Multiple Tumor Models.

中文標(biāo)題：一種有效的微米級(jí)新抗原腫瘤疫苗GP-新抗原在多種腫瘤模型中誘導(dǎo)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性

發(fā)表期刊：《ADVANCED SCIENCE》

影響因子：14.3

作者單位：

1. State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Tianjin Key Laboratory of Protein Sciences, College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, P. R. China

2. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui, Henan Province 453100, P. R. China

作者信息：Zhe Jing, Shuqing Wang, Keyuan Xu, Qian Tang, Wenjing Li, Wei Zheng, Haobo Shi, Kailing Su, Yanting Liu, Zhangyong Hong.

研究背景

腫瘤特異性新抗原，源自腫瘤基因中的非同義點(diǎn)突變，被認(rèn)為是引發(fā)腫瘤免疫排斥反應(yīng)的理想靶標(biāo)。這些新抗原不受中樞免疫耐受的限制，能夠激發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，同時(shí)避免了引發(fā)自身免疫疾病的風(fēng)險(xiǎn)。個(gè)性化的基于新抗原的腫瘤疫苗已成為癌癥免疫治療的一個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域，并在全球范圍內(nèi)進(jìn)行著眾多的臨床試驗(yàn)。盡管如此，如何有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量針對(duì)新抗原的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)仍是該領(lǐng)域面臨的主要技術(shù)挑戰(zhàn)。目前，主要的免疫策略包括將新抗原的長肽與PolyI:C佐劑結(jié)合或采用mRNA疫苗技術(shù)，但這些方法的效率有限。為了提高T細(xì)胞免疫反應(yīng)的效率和治療效果，已經(jīng)開發(fā)了一些基于合成聚合物、脂質(zhì)體和膜囊泡的顆粒疫苗系統(tǒng)。然而，這些系統(tǒng)制備的疫苗顆粒在大小和表面結(jié)構(gòu)上通常不均勻，且批次間一致性差，這影響了疫苗顆粒免疫性能的評(píng)估和臨床應(yīng)用，因?yàn)橐呙珙w粒的大小和形狀對(duì)其免疫性能有顯著影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：GP-新抗原抗原裝載系統(tǒng)的制備與特性分析

(A)GP-新抗原疫苗激活抗腫瘤免疫反應(yīng)并誘導(dǎo)腫瘤凋亡的示意圖。

(B)GP-新抗原抗原裝載系統(tǒng)的制備流程圖。

(C)通過HPLC監(jiān)測半胱氨酸-OVA257-264與DBCO-PEG4-馬來酰亞胺的反應(yīng)效率。紅線表示不同的標(biāo)準(zhǔn)半胱氨酸-OVA257-264，黑線表示DBCO-PEG4-馬來酰亞胺，藍(lán)線表示高純度產(chǎn)品。

(D)通過HPLC監(jiān)測DBCO-OVA257-264與GP-N3的偶聯(lián)效率。黑線表示DBCO-OVA257-264。箭頭指示實(shí)際的DBCO-OVA257-264，而另一個(gè)較小的峰是稍微過量的未反應(yīng)的半胱氨酸肽。紅線表示偶聯(lián)反應(yīng)后的上清液。

(E)GP、GP-N3和GP-OVA257-264的掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡圖像。

(F,G)分別在制備后(F)或在37°C儲(chǔ)存不同時(shí)間后(G)通過動(dòng)態(tài)光散射分析GP、GP-N3和GP-OVA257-264的粒徑。

H) 共聚焦激光掃描顯微鏡圖像，顯示RhoB標(biāo)記的OVA257-264肽偶聯(lián)在GP表面的GP顆粒。

圖2：GP-OVA257-264顆粒通過APCs的攝取激活和交叉呈遞。

(A)共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖像顯示GP-OVA257-264被骨髓源性樹突狀細(xì)胞(BMDCs)攝取。BMDCs與GP-OVA257-264-RhoB共孵育24小時(shí)，細(xì)胞核和細(xì)胞膜分別用DAPI和FITC標(biāo)記的CD11c抗體標(biāo)記。

(B)BMDCs中GP-OVA257-264顆粒的溶酶體定位的CLSM圖像。BMDCs與GP-OVA257-264-RhoB共孵育24小時(shí)，溶酶體用Lysotracker Green標(biāo)記。

(C-E)GP-OVA257-264在體內(nèi)的位置和遷移的活體成像。BALB/c小鼠皮下接種GP-OVA257-264-Cy5或?qū)φ战M，顯示接種小鼠(C)、引流淋巴結(jié)(D)的熒光圖像，以及與PBS接種小鼠相比，引流淋巴結(jié)中Cy5的相對(duì)熒光強(qiáng)度(E)在免疫后24、48和72小時(shí)的情況。C中的黑色箭頭表示注射部位。

(F-H)FACS分析體內(nèi)APCs的攝取。C57BL/6小鼠在腹股溝區(qū)域皮下接種FITC標(biāo)記的OVA257-264、GP或GP-OVA257-264-FITC，24小時(shí)后收集引流淋巴結(jié)。通過FACS分析DCs(F)、巨噬細(xì)胞(G)和B細(xì)胞(H)的攝取比例。PBS和未標(biāo)記FITC的GPs作為陰性對(duì)照。

(I,J)GP-OVA257-264激活BMDCs。BMDCs與GP-OVA257-264和對(duì)照組共孵育。通過ELISA檢測IL-6和IL-12 p70的釋放(I)，并通過FACS檢測激活標(biāo)記物CD80、CD86、CD40、MHC-I和MHC-II的表達(dá)(J)。

(K,L)FACS分析BMDCs中OVA257-264肽交叉呈遞效率。代表性流式細(xì)胞圖和定量顯示BMDCs中OVA257-264-H-2Kb的頻率在2小時(shí)(K)。顯示BMDCs交叉呈遞效率的動(dòng)態(tài)圖(L)。數(shù)據(jù)表示均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過單向方差分析和Tukey的顯著性差異多重比較計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。

圖3：OVA肽偶聯(lián)GP顆粒誘導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)

(A,B)體外OT-1 TCR轉(zhuǎn)基因CD8+ T細(xì)胞增殖被GP-OVA257-264顆粒和對(duì)照組刺激。顯示體外OT-1增殖實(shí)驗(yàn)的示意圖(A)和FACS的直方圖(B)。(C,D)體內(nèi)OT-1 TCR轉(zhuǎn)基因CD8+ T細(xì)胞增殖被GP-OVA257-264顆粒和對(duì)照組刺激。顯示體內(nèi)OT-1增殖實(shí)驗(yàn)的示意圖(C)和FACS的直方圖(D)。(E–I)OVA257-264特異性CD8+ T細(xì)胞的增殖和激活。C57BL/6小鼠每14天腹股溝接種兩次GP-OVA257-264和對(duì)照組。然后，代表性的流式細(xì)胞圖(E)、OVA257-264特異性CD8+ T細(xì)胞的定量頻率(F)，以及在第二次免疫后7天通過FACS測量的脾細(xì)胞中na?ve(G)或中央記憶CD8+ T細(xì)胞(H)的頻率。接種小鼠的脾細(xì)胞被OVA257-264體外再次刺激，通過ELISpot實(shí)驗(yàn)檢測IFN-γ+ CD8+ T細(xì)胞增殖(I)。(J–L)體內(nèi)OVA特異性CD8+ T細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)。顯示體內(nèi)CD8+ T細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)的示意圖(J)、直方圖(K)和細(xì)胞溶解比率(L)。(M–O)OVA特異性抗體滴度的ELISA。C57BL/6小鼠腹股溝接種GP-OVA323-339和對(duì)照組，第二次、第三次和第四次免疫后第7天采集外周血進(jìn)行ELISA分析。顯示OVA特異性IgG(M)、IgG1(N)和IgG2a(O)的動(dòng)態(tài)抗體滴度。數(shù)據(jù)表示均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過單向方差分析和Tukey的顯著性差異多重比較計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性。* p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001。M–O中的黑色與OVA323-339相比，M,O中的紅色與OVA相比。

圖4：GP-OVA257-264聯(lián)合TLR激動(dòng)劑在EG7·OVA腫瘤模型中的抗腫瘤效果

在預(yù)防性模型中，該疫苗能減緩腫瘤生長并維持小鼠體重。在治療性模型中，與對(duì)照組相比，GP-OVA257-264處理的小鼠腫瘤生長得到控制，體重變化較小。此外，GP-OVA257-264與TLR激動(dòng)劑聯(lián)合使用在預(yù)防和治療模型中均提高了小鼠的存活率?；铙w成像顯示，GP-OVA257-264與PolyI:C聯(lián)合使用能增強(qiáng)疫苗顆粒的遷移至引流淋巴結(jié)。這些結(jié)果表明，GP-OVA257-264是一種有效的抗腫瘤疫苗候選物，尤其在與TLR激動(dòng)劑聯(lián)合使用時(shí)。

圖5：GP-M30在B16F10黑色素瘤模型中誘導(dǎo)了針對(duì)B16F10新抗原M30的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗腫瘤活性

(A-C)對(duì)M30特異性CD8+ T細(xì)胞的IFN-γ+ ELISpot和ELISA檢測。C57BL/6小鼠接種M30或與PolyI:C或CpG 2395聯(lián)合的GP-M30兩次。一部分接種小鼠的脾細(xì)胞被M30或B16F10細(xì)胞體外再次刺激，并用ELISpot檢測(A)，另一部分被M30(B)或OVA257-264(C)體外再次刺激，并用ELISA檢測。(D-F)在預(yù)防性肺轉(zhuǎn)移B16F10黑色素瘤模型中的抗腫瘤活性。預(yù)防性肺轉(zhuǎn)移B16F10黑色素瘤模型的示意圖(D)，小鼠每14天皮下接種三次。第三次免疫后第7天，小鼠靜脈挑戰(zhàn)性地接種1×105 B16F10細(xì)胞。小鼠在腫瘤挑戰(zhàn)后20天被安樂死，展示不同小鼠的肺部圖像(E)和B16F10肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量(F)。(G-J)對(duì)(D-F)中接種小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞分化的FACS分析。展示T細(xì)胞向CD4+ T(G)或CD8+ T(H)細(xì)胞分化的比例，以及CD8+ T細(xì)胞向TEM(I)或TCM(J)分化的比例。數(shù)據(jù)表示均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過單向方差分析和Tukey的顯著性差異多重比較計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性。* p < 0.05, ** p < 0.01。

圖6：GP-M25疫苗在4T1乳腺癌模型中激發(fā)特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)及抗腫瘤效果

(A-C)對(duì)M25特異性CD8+ T細(xì)胞的IFN-γ+ ELISpot和ELISA檢測。BALB/c小鼠接種M25或與CpG 2395聯(lián)合或不聯(lián)合的GP-M25兩次。一部分接種小鼠的脾細(xì)胞被M25體外再次刺激，并用ELISpot檢測(A)，另一部分被M25(B)或M35(C)體外再次刺激，并用ELISA檢測。(D-F)在預(yù)防性4T1模型中的抗腫瘤活性。D) 預(yù)防性4T1模型的示意圖，小鼠每14天皮下接種三次不同疫苗。在最后一次免疫后第7天，小鼠被挑戰(zhàn)性地接種1×105 4T1細(xì)胞。腫瘤生長曲線(E)和CD45+腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中CD4+/CD8+ T細(xì)胞的比例(F)被描繪出來(n=5)。數(shù)據(jù)表示均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過單向方差分析和Tukey的顯著性差異多重比較計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性，在(D)中代表與M25相比。p < 0.05, ** p < 0.01。

圖7：GP-ME1-ME4在CT26結(jié)腸癌模型中誘導(dǎo)了針對(duì)CT26新抗原的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗腫瘤激活

(A,B)對(duì)ME1/ME4特異性CD8+ T細(xì)胞的IFN-γ+ ELISpot和ELISA檢測。BALB/c小鼠接種ME1+ME4或與CpG 2395聯(lián)合或不聯(lián)合的GP-ME1-ME4兩次。接種小鼠的脾細(xì)胞被ME1或ME4新抗原體外再次刺激，通過A) ELISpot和B) ELISA檢測IFN-γ+ CD8+ T細(xì)胞的增殖。(C,D)在預(yù)防性CT26模型中的抗腫瘤免疫。預(yù)防性CT26模型的示意圖(C)，小鼠每14天皮下接種三次，最后一次免疫后7天挑戰(zhàn)性地接種1×105 CT26細(xì)胞。腫瘤生長曲線(D)被描繪出來(n=5)。(E–H)在治療性CT26模型中的抗腫瘤免疫。治療性腫瘤模型的示意圖(E)，小鼠首先被接種5×105 CT26細(xì)胞，然后在腫瘤接種后第5、8、12天皮下接種三次。整體腫瘤生長曲線(F)、存活和無瘤率(G)以及不同疫苗的腫瘤生長曲線(H)被描繪出來。紅色箭頭指示接種時(shí)間點(diǎn)。數(shù)據(jù)表示均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。通過單向方差分析和Tukey的顯著性差異多重比較計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性，* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。

研究結(jié)論

研究人員成功開發(fā)了一種新型基于酵母多糖殼顆粒的腫瘤疫苗系統(tǒng)GP-Neoantigen，該系統(tǒng)能夠強(qiáng)效激活機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多種新抗原肽的特異性CD8+ T細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效應(yīng)用于腫瘤治療。與合成納米顆粒系統(tǒng)相比，GP-Neoantigen制備簡單、批次穩(wěn)定，具有均勻的顆粒大小，并且能高度特異性地被抗原呈遞細(xì)胞(APCs)如DCs和巨噬細(xì)胞攝取。在動(dòng)物模型中，該顆粒系統(tǒng)展現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫激活能力，有效抑制了包括EG7·OVA淋巴瘤、B16F10黑色素瘤、4T1乳腺癌和CT26結(jié)腸癌在內(nèi)的多種小鼠同種腫瘤模型中腫瘤的生長。此外，與PolyI:C或CpG 2395佐劑聯(lián)合使用時(shí)，腫瘤抑制效果進(jìn)一步顯著增強(qiáng)。尤為重要的是，這種策略不僅能在多個(gè)小鼠模型中實(shí)現(xiàn)腫瘤的完全清除，還能在清除腫瘤的小鼠中誘導(dǎo)長期的腫瘤排斥記憶，避免腫瘤再生長。這些研究成果為GP-Neoantigen疫苗系統(tǒng)的臨床推廣及個(gè)性化疫苗接種治療提供了廣闊前景。