乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，有超過2.5億人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我國，人數(shù)接近1億人。NTCP工具細胞，特別是外源表達NTCP的肝癌細胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重現(xiàn)性佳的特點，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演著至關(guān)重要的角色。這些細胞模型能夠有效模擬HBV的感染過程，為研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒復(fù)制以及藥物篩選提供了一個強大而便捷的體外平臺。它們不僅有助于揭示HBV感染的分子機制，如DDX3作為宿主限制因子阻礙cccDNA轉(zhuǎn)錄，GPC5作為附著因子在感染入胞過程中的作用，還能通過直接與NTCP相互作用或下調(diào)NTCP表達來篩選和驗證抗病毒藥物的活性，例如環(huán)孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，這些工具細胞還促進了對HBV宿主特異性分子的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)展支持HBV感染的小動物模型提供了可能，這對于乙肝相關(guān)研究和藥物開發(fā)具有重大意義。

基本信息

英文標(biāo)題：Immunomodulation and RNA interference alter hepatitis B virus–specific CD8 T-cell recognition of infected HepG2-NTCP

中文標(biāo)題：免疫調(diào)節(jié)和RNA干擾改變感染HepG2-NTCP的HBV特異性CD8 T細胞的識別

發(fā)表期刊：《Hepatology》

影響因子：12.9

作者單位：

1. Department of Immunology, University of Toronto, Toronto, Ontario, Canada

2. Toronto Center for Liver Disease, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, Toronto, Ontario, Canada

作者信息：

Adrian Kuipery, Juan Diego Sanchez Vasquez, Aman Mehrotra, Jordan J. Feld, Harry L. A. Janssen, Adam J. Gehring

研究背景

CD8 T細胞在控制HBV(乙型肝炎病毒)感染中扮演著至關(guān)重要的角色，它們可以直接殺傷感染的肝細胞或通過產(chǎn)生IFN-γ來清除病毒。目前正在開發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑和針對HBV的RNA干擾(RNAi)治療，如慢性乙型肝炎(CHB)的治療，這些治療可能在除了它們的主要作用機制外，還會改變HBV抗原的呈遞并影響CD8 T細胞的識別。核苷(酸)類似物(NUCs)能夠抑制HBV的復(fù)制和肝炎癥，但它們不能消除cccDNA和病毒抗原，也不能恢復(fù)抗病毒免疫，因此需要長期使用以防止疾病進展和病毒復(fù)發(fā)。新的治療方法，如TLR7/8激動劑和siRNA，旨在抑制HBV復(fù)制和/或抗原產(chǎn)生，或誘導(dǎo)具有直接抗病毒活性的細胞因子。了解抗原減少如何影響肝細胞上T細胞的識別對于T細胞刺激方法至關(guān)重要，這也可能指導(dǎo)siRNA等抗原減少劑的停藥時機。TLR激動劑可以驅(qū)動肝內(nèi)的免疫反應(yīng)，并可能增強HBV特異性CD8 T細胞對感染肝細胞的識別。因此，了解siRNA和免疫調(diào)節(jié)劑如何改變HBV特異性CD8 T細胞對感染肝細胞的識別對于未來HBV治療策略的制定具有重要意義。

研究方法

在本研究中，作者采用了一系列的實驗方法來探究HBV特異性CD8 T細胞的生產(chǎn)、HBV對HepG2-NTCP細胞的感染、替諾福韋酯(TDF)的處理效果、以及在條件培養(yǎng)基(CM)中細胞因子的定量。作者通過離心和DNA提取來定量細胞培養(yǎng)上清中的HBV松弛環(huán)狀DNA，并利用免疫熒光測定來評估HBcAg的表達。此外，作者將HBV特異性CD8 T細胞與HepG2-NTCP細胞進行共培養(yǎng)，以研究T細胞對HBV感染細胞的識別能力。作者還生成了CM并對HepG2-NTCP細胞進行了TLR激動劑的處理，以及使用siRNA技術(shù)對免疫蛋白酶體和HBV特異性基因進行敲低。最后，作者通過統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行了分析，以評估實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義。這些方法為作者提供了一個全面的實驗框架，以便深入理解HBV感染機制和免疫反應(yīng)。

實驗結(jié)果

圖1：“HepG2-NTCP體外感染模型：HBV感染特性、抗原表達及CD8 T細胞識別研究”

(A)HepG2-NTCP細胞被HBV感染，通過qPCR監(jiān)測細胞培養(yǎng)上清中HBV的滴度，并以基因組當(dāng)量(GE)每毫升的形式繪制圖表。

(B)用1000 MOI(感染復(fù)數(shù))感染HepG2-NTCP細胞的HBcAg(乙型肝炎核心抗原)表達。HBcAg染色(底部)，與DAPI(頂部;DAPI=藍色，HBcAg=紅色)疊加并偽彩色處理，100倍放大。

(C)在100 MOI感染下，HBV特異性CD8 T細胞對HepG2-NTCP感染(±)的識別?？v向監(jiān)測HBcAg特異性(左側(cè))和HBsAg特異性(右側(cè))CD8 T細胞反應(yīng)。

(D)感染的MOI增加與HBV特異性CD8 T細胞對感染HepG2-NTCP的識別增加相對應(yīng)。

(C)和(D)的陽性對照為用1 μm的HBc18-27或HBs183-191脈沖處理的HepG2-NTCP細胞。實驗結(jié)果代表了三次獨立實驗。**表示p < 0.01;****表示p < 0.001。

圖2：“核苷(酸)類似物對HBV感染細胞CD8 T細胞識別的影響研究”

(A)HepG2-NTCP細胞被處理(±)與TDF(10 μm)長達9天。未處理的(頂部)和TDF處理的(底部)，100倍放大，疊加DAPI(藍色)和HBcAg(紅色)。

(B)TDF處理抑制HepG2-NTCP中的HBV復(fù)制。

(C)TDF處理并沒有抑制HBcAg特異性CD8 T細胞對感染細胞的識別。每48小時補充一次TDF。*p < 0.05; ****p < 0.001。

圖3：免疫調(diào)節(jié)化合物通過免疫激活間接改變CD8 T細胞識別

(A)通過細胞計數(shù)珠陣列(cytometric bead array)測量CM(培養(yǎng)基)中的細胞因子組成(N = 8個健康供體CM)。(B)直接通過TLR(Toll樣受體)刺激HepG2-NTCP細胞不會改變CD8 T細胞對HBcAg(左側(cè))或HBsAg(右側(cè))的識別。實驗結(jié)果代表了三次獨立實驗。(C)TLR刺激的CM增強了感染HepG2-NTCP中CD8 T細胞對HBcAg(左側(cè))和HBsAg(右側(cè))的識別(N = 5個健康供體CM)。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005。

圖4：探究增強CD8 T細胞識別感染細胞的機制

(A)直接通過TLR(Toll樣受體)刺激HepG2-NTCP細胞并未改變MHC-I(主要組織相容性復(fù)合體I)的呈遞。(B)TLR刺激的培養(yǎng)基(CM)上調(diào)了HepG2-NTCP細胞上MHC-I的呈遞。實驗(A)和(B)代表了三次獨立實驗的結(jié)果。(C)在TLR和CM處理的HepG2-NTCP細胞中定量了組成型蛋白酶體和免疫蛋白酶體，與未刺激的CM相比，統(tǒng)計結(jié)果相對應(yīng)。在TLR CM處理后，通過siRNA敲低PSMB8、-9和-10，抑制了HBsAg特異性CD8 T細胞的識別，但不影響HBcAg特異性CD8 T細胞的識別。(E)細胞因子阻斷實驗表明，TLR7 CM通過I型干擾素增強了HBsAg特異性CD8 T細胞的激活，而TLR8 CM則依賴于IFN-γ。*p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.001。Ab, 抗體;Cond. Media NS, 未刺激的培養(yǎng)基;siPSMB, PSMB的siRNA敲低。

圖5：siHBV抑制CD8 T細胞對感染細胞的識別

(A)HepG2-NTCP細胞被轉(zhuǎn)染了siHBV。使用200倍放大的顯微鏡觀察并疊加DAPI(藍色)和HBcAg(紅色)，并隨時間監(jiān)測和定量HBcAg的表達。(B)使用ImageJ軟件(美國國立衛(wèi)生研究院，馬里蘭州貝塞斯達)對三個視野的圖像進行分析。(C)用siHBV處理HepG2-NTCP細胞抑制了HBV復(fù)制和(D)HBsAg的產(chǎn)生。與用載體處理的感染細胞進行歸一化比較。(E)siRNA處理HepG2-NTCP細胞抑制了HBcAg特異性CD8 T細胞對感染細胞的識別。與用載體處理的感染細胞進行歸一化比較。(F)siHBV能夠在TLR CM處理后抑制HBcAg和HBsAg特異性CD8 T細胞的識別。與肽脈沖陽性對照進行歸一化比較。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005; ****p < 0.001。

研究結(jié)論

在實驗中，HBV感染的HepG2-NTCP細胞經(jīng)過不同的處理后，結(jié)果顯示：使用替諾福韋酯(TDF)能夠減少病毒復(fù)制，但對CD8 T細胞識別感染細胞沒有影響;直接將TLR7/8激動劑作用于感染的HepG2-NTCP細胞并未改變T細胞的識別能力;而將感染的HepG2-NTCP細胞暴露于TLR7/8條件培養(yǎng)基(CM)中，則通過I型干擾素(IFN)和IFN-γ依賴的機制增強了HBV特異性CD8 T細胞的識別;RNAi技術(shù)迅速抑制了HBV-DNA、HBcAg和HBsAg的表達，從而影響了HBV特異性CD8 T細胞的識別。這些發(fā)現(xiàn)表明，免疫調(diào)節(jié)和RNAi能夠改變HBV特異性CD8 T細胞對感染HepG2-NTCP細胞的識別，而核苷(酸)類似物則不能。這些認識對于制定慢性乙型肝炎的聯(lián)合治療策略具有重要意義。