基本信息

英文標(biāo)題：Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2

中文標(biāo)題：低劑量二甲雙胍通過(guò)PEN2靶向溶酶體AMPK通路

發(fā)表期刊：《Nature》

影響因子：64.8

作者單位：廈門(mén)大學(xué)

作者信息：林圣彩院士團(tuán)隊(duì)、鄧賢明團(tuán)隊(duì)

研究背景

二甲雙胍是治療2型糖尿病的常用藥物，具有抗衰老和抗癌的潛力。雖然AMPK在二甲雙胍的作用機(jī)制中起重要作用，但其直接分子靶點(diǎn)尚未明確。

探討二甲雙胍在臨床相關(guān)濃度下如何激活A(yù)MPK，以及其對(duì)細(xì)胞內(nèi)AMP水平的影響。

研究者使用了多種細(xì)胞模型和生化分析方法，包括Western blot、酶活測(cè)定、細(xì)胞代謝分析等，以研究二甲雙胍對(duì)溶酶體v-ATPase的抑制作用及其對(duì)AMPK激活的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在臨床相關(guān)濃度下通過(guò)抑制溶酶體質(zhì)子泵v-ATPase來(lái)激活A(yù)MPK，而不影響細(xì)胞內(nèi)的AMP水平。這表明二甲雙胍的作用機(jī)制可能涉及溶酶體功能的調(diào)節(jié)。

本研究揭示了二甲雙胍通過(guò)抑制溶酶體質(zhì)子泵v-ATPase來(lái)激活A(yù)MPK的新機(jī)制，為理解二甲雙胍的生物學(xué)效應(yīng)提供了新的視角，并為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。

研究方法

微陣列基因表達(dá)譜 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到與心肌I/R損傷相關(guān)的mRNA數(shù)據(jù)集GSE4105和miRNA數(shù)據(jù)集GSE50885。構(gòu)建了小鼠心肌I/R損傷模型，并對(duì)心肌組織進(jìn)行了circRNA測(cè)序。

小鼠心肌I/R損傷模型的建立 使用了104只雄性C57BL/6小鼠，其中88只用于構(gòu)建心肌I/R損傷模型，76只建模成功，其余16只進(jìn)行了假手術(shù)。

心肌組織circRNA測(cè)序 建立了兩個(gè)小鼠心肌I/R損傷模型用于測(cè)序，并使用兩個(gè)正常心臟樣本作為對(duì)照。

心臟功能指數(shù)測(cè)定 建模后7天，通過(guò)超聲檢測(cè)小鼠的心臟功能指數(shù)。

Evans Blue/TTC雙重染色 通過(guò)Evans Blue/TTC雙重染色來(lái)確定心肌缺血和梗死的面積。

HE染色 對(duì)石蠟包埋的心肌組織進(jìn)行HE染色，以觀察組織結(jié)構(gòu)。

透射電鏡(TEM) 使用透射電鏡觀察小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

H/R細(xì)胞模型的開(kāi)發(fā)和細(xì)胞處理 從1-2天大的C57BL/6小鼠中分離出心肌細(xì)胞，并在缺氧/復(fù)氧條件下處理。

免疫熒光檢測(cè) 通過(guò)免疫熒光檢測(cè)LC3熒光斑點(diǎn)的數(shù)量和分布。

Hoechst 33258染色 使用Hoechst 33258染色來(lái)觀察細(xì)胞核形態(tài)。

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證circ_ZNF512和miR-181d-5p之間的結(jié)合。

細(xì)胞質(zhì)/核分離試驗(yàn) 使用PARIS試劑盒分離細(xì)胞質(zhì)和核成分。

RIP實(shí)驗(yàn) 使用RIP試劑盒來(lái)分析circ_ZNF512/miR-181d-5p和Ago2的結(jié)合。

RNA下拉實(shí)驗(yàn) 通過(guò)RNA下拉實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)circ_ZNF512的富集。

RNA分離和定量 從心肌組織和細(xì)胞中分離并定量總RNA。

Western Blot分析 通過(guò)Western Blot分析來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：二甲雙胍通過(guò)不增加AMP/ADP水平激活A(yù)MPK。

a. 在小鼠原代肝細(xì)胞中，低劑量二甲雙胍使溶酶體去酸化(左)。細(xì)胞用5μM二甲雙胍(Met)處理2小時(shí)，Lysosensor的相對(duì)熒光強(qiáng)度如右圖所示。

b. 二甲雙胍不會(huì)增加小鼠原代肝細(xì)胞中的AMP/ADP水平。細(xì)胞用5μM二甲雙胍處理指定時(shí)間后，通過(guò)免疫印跡(IB;左)分析磷酸化的(p)-AMPKα和p-ACC，通過(guò)質(zhì)譜法(底部右)分析AMP/ATP和ADP/ATP比率，AMP、ADP和ATP的絕對(duì)濃度。用PBS洗滌三次后，通過(guò)質(zhì)譜法(頂部右)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)二甲雙胍濃度(conc.)。有關(guān)凝膠源數(shù)據(jù)，請(qǐng)參見(jiàn)補(bǔ)充圖1。數(shù)據(jù)為均值?±?標(biāo)準(zhǔn)誤差，n值在每個(gè)面板上都有標(biāo)記。P值使用雙側(cè)Mann–Whitney檢驗(yàn)(a)或單因素方差分析(ANOVA)后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)(b，底部右)或Sidak檢驗(yàn)(b，頂部右)計(jì)算。a中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次，b中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了五次。

要點(diǎn)：

低劑量二甲雙胍能夠使小鼠原代肝細(xì)胞中的溶酶體去酸化。

二甲雙胍處理后，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)到磷酸化的AMPKα和p-ACC水平增加，表明AMPK被激活。

質(zhì)譜分析顯示，二甲雙胍處理后，細(xì)胞內(nèi)的AMP/ATP和ADP/ATP比率沒(méi)有顯著變化，AMP、ADP和ATP的絕對(duì)濃度也沒(méi)有增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍通過(guò)不增加AMP/ADP水平來(lái)激活A(yù)MPK。

本研究中的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)分別為a部分三次，b部分五次，以確保數(shù)據(jù)的可靠性。

圖2：PEN2與二甲雙胍結(jié)合，并且是低劑量二甲雙胍誘導(dǎo)的AMPK激活所必需的

a. 一個(gè)示意圖，展示了使用光活性二甲雙胍探針(Met-P)從純化自MEFs的溶酶體蛋白提取物中識(shí)別二甲雙胍靶點(diǎn)的親和力為基礎(chǔ)的方法。MS，質(zhì)譜。

b, c. Pen2基因敲除阻斷了低劑量二甲雙胍激活的AMPK。小鼠原代肝細(xì)胞(b)和MEFs(c;克隆1，除非另有說(shuō)明，否則后續(xù)均為此克隆)分別用5μM和200μM二甲雙胍處理2小時(shí)和12小時(shí)，然后分析p-AMPKα和p-ACC。WT，野生型。

d, e. MEFs的STORM圖像(d)和HEK293T細(xì)胞的TEM圖像(e)顯示PEN2的一部分定位于溶酶體(e，黑色箭頭)，并與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP2(d)重疊。

f, g. PEN2能夠與二甲雙胍結(jié)合。f, 在SPR測(cè)定中，PEN2與指定濃度的二甲雙胍孵育。g, 在Met-P1結(jié)合測(cè)定中，轉(zhuǎn)染PEN2或PEN2-2A的HEK293T細(xì)胞被裂解，與10μM Met-P1孵育，然后生物素化，接著進(jìn)行生物素化蛋白質(zhì)的親和力沉淀(AP)。

h. PEN2-2A不介導(dǎo)二甲雙胍激活的AMPK。Pen2–/– MEFs重新引入了帶有HA標(biāo)簽的PEN2-2A，用200μM二甲雙胍處理12小時(shí)，然后分析p-AMPKα和p-ACC。有關(guān)凝膠源數(shù)據(jù)，請(qǐng)參見(jiàn)補(bǔ)充圖1。本圖中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次，除了b和c，它們進(jìn)行了四次。

要點(diǎn)：

通過(guò)親和力方法，使用光活性二甲雙胍探針(Met-P)從MEFs的溶酶體蛋白提取物中鑒定出二甲雙胍的靶點(diǎn)，并通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。

在小鼠原代肝細(xì)胞和MEFs中，Pen2基因敲除后，低劑量二甲雙胍無(wú)法激活A(yù)MPK，表明PEN2在二甲雙胍激活A(yù)MPK中起關(guān)鍵作用。

STORM和TEM圖像顯示，PEN2在MEFs和HEK293T細(xì)胞中部分定位于溶酶體，并與溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP2重疊。

SPR和Met-P1結(jié)合測(cè)定表明，PEN2能夠與二甲雙胍結(jié)合。

在Pen2–/– MEFs中重新引入PEN2-2A后，二甲雙胍無(wú)法激活A(yù)MPK，說(shuō)明PEN2-2A不介導(dǎo)二甲雙胍的AMPK激活作用。

本圖中的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為三次，除了b和c部分進(jìn)行了四次，以確保結(jié)果的可靠性。

圖3：ATP6AP1將PEN2與v-ATPase連接起來(lái)以激活A(yù)MPK

a–c. 通過(guò)免疫共沉淀(IP)和免疫印跡(IB)確定ATP6AP1是PEN2的相互作用蛋白。a, 在表達(dá)HA–PEN2或Myc–ATP6AP1的HEK293T細(xì)胞裂解物中孵育10μM二甲雙胍，然后進(jìn)行PEN2和AP1蛋白的免疫共沉淀。b, c, 分別在野生型MEFs、Pen2–/– MEFs或Atp6ap1–/– MEFs的裂解物中孵育10μM二甲雙胍，然后進(jìn)行PEN2和AP1蛋白的免疫共沉淀。

d. 二甲雙胍不促進(jìn)ATP6AP1與PEN2-20A之間的相互作用。轉(zhuǎn)染HA標(biāo)簽的PEN2或PEN2-20A的HEK293T細(xì)胞裂解物按照a中的方法處理，然后通過(guò)IP和IB分析ATP6AP1與PEN2的相互作用。

e–i. 失去PEN2–ATP6AP1相互作用會(huì)廢除二甲雙胍對(duì)AMPK激活的影響。e, 在Atp6ap1–/– MEFs中重新引入ATP6AP1Δ420–40，f, 在Pen2–/– MEFs中重新引入PEN2-20A突變體，然后用200μM二甲雙胍處理12小時(shí)，隨后分析p-AMPK和p-ACC。g–i, 分析了ATP6AP1和PEN2突變體對(duì)AXIN向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)(g)以及AXIN為基礎(chǔ)的復(fù)合物形成(h, i)的影響。Concanamycin?A(conA;5μM，2小時(shí))用作對(duì)照。FL，全長(zhǎng)。

j. 一個(gè)示意圖，展示了二甲雙胍–PEN2–ATP6AP1和FBP–醛縮酶軸構(gòu)成兩條匯合到v-ATPase的輸入分流，通過(guò)溶酶體途徑引發(fā)AMPK激活。有關(guān)凝膠源數(shù)據(jù)，請(qǐng)參見(jiàn)補(bǔ)充圖1。數(shù)據(jù)為均值?±?標(biāo)準(zhǔn)誤差，n值在每個(gè)面板上都有標(biāo)記，P值使用雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)(a，針對(duì)Myc–ATP6AP1)、雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)帶Welch’s校正(a，針對(duì)HA–PEN2)或雙向ANOVA，隨后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn)(g)計(jì)算。本圖中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次，除了a部分進(jìn)行了四次，h和i部分進(jìn)行了五次。

要點(diǎn)：

通過(guò)免疫共沉淀和免疫印跡技術(shù)，確定了ATP6AP1是PEN2的相互作用蛋白，并且這種相互作用在二甲雙胍處理后增強(qiáng)。

二甲雙胍不促進(jìn)ATP6AP1與PEN2-20A之間的相互作用，表明PEN2的特定區(qū)域?qū)τ谂cATP6AP1的結(jié)合是必要的。

在Atp6ap1–/– MEFs中重新引入ATP6AP1Δ420–440突變體，以及在Pen2–/– MEFs中重新引入PEN2-20A突變體后，二甲雙胍無(wú)法激活A(yù)MPK，說(shuō)明PEN2–ATP6AP1相互作用對(duì)于二甲雙胍激活A(yù)MPK是必需的。

分析了ATP6AP1和PEN2突變體對(duì)AXIN向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)以及AXIN為基礎(chǔ)的復(fù)合物形成的影響，發(fā)現(xiàn)這些過(guò)程受到PEN2–ATP6AP1相互作用的影響。

提出了一個(gè)模型，說(shuō)明二甲雙胍通過(guò)與PEN2結(jié)合，進(jìn)而與ATP6AP相互作用，最終通過(guò)溶酶體途徑激活A(yù)MPK。

本圖中的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為三次，除了a部分進(jìn)行了四次，h和i部分進(jìn)行了五次，以確保結(jié)果的可靠性。

圖4：PEN2和ATP6AP1是二甲雙胍生物效應(yīng)所必需的

a, b. 腸道PEN2對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的血糖降低效應(yīng)是必需的。PEN2-IKO小鼠按照擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12d所示給予二甲雙胍。然后進(jìn)行口服葡萄糖耐量測(cè)試分析(a)、測(cè)量十二指腸二甲雙胍濃度(b，左)以及在葡萄糖灌胃前后的血漿GLP-1水平測(cè)量(b，右)。

c, d. PEN2對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的肝臟脂肪減少是必需的。在肝臟中特異性敲除Pen2的小鼠按照擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12f所示給予二甲雙胍。在二甲雙胍治療16周后，顯示小鼠的腹腔內(nèi)葡萄糖耐量測(cè)試結(jié)果(c)和肝臟TAG水平(d)。

e, f. ATP6AP1對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的肝臟脂肪減少是必需的。小鼠按照擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖12m所示給予二甲雙胍。在二甲雙胍治療16周后，顯示小鼠的腹腔內(nèi)葡萄糖耐量測(cè)試結(jié)果(e)和肝臟TAG水平(f)。

g, h. PEN2和ATP6AP1是二甲雙胍誘導(dǎo)的壽命延長(zhǎng)所必需的。用siRNA敲低pen-2(T28D6.9)的WT(N2)線蟲(chóng)(g)或表達(dá)全長(zhǎng)ATP6AP1或ATP6AP1Δ420–440的ATP6AP1–/–(vha-19)線蟲(chóng)(h)用50?mM二甲雙胍處理。壽命數(shù)據(jù)以Kaplan–Meier曲線顯示(統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)補(bǔ)充表3)。Ctrl，對(duì)照。

i, j. PEN2和ATP6AP1是飲食中0.1%二甲雙胍誘導(dǎo)的AMPK激活所必需的。5周齡的PEN2-LKO小鼠(i;4周齡時(shí)注射他莫昔芬)或8周齡的表達(dá)ATP6AP1Δ420–440的ATP6AP1-LKO小鼠(j;4周齡時(shí)注射病毒，5周齡時(shí)注射他莫昔芬)按照之前描述的方法10給予含有0.1%二甲雙胍的正常飼料1周。然后通過(guò)免疫印跡分析肝臟AMPK激活。有關(guān)凝膠源數(shù)據(jù)，請(qǐng)參見(jiàn)補(bǔ)充圖1。數(shù)據(jù)以均值?±?標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示，n值在每個(gè)面板上都有標(biāo)記，P值使用雙向重復(fù)測(cè)量ANOVA，隨后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn)(a, c和e比較WT/ATP6AP1-FL?+?Met組和PEN2-IKO/LKO/ATP6AP1Δ420–440?+?Met組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖水平;另見(jiàn)a, c和e的插圖中的接收者操作特征曲線(AUC)值，以及使用雙向ANOVA，隨后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn)的P值)，雙側(cè)Student’s t檢驗(yàn)(b，左)，以及雙向ANOVA，隨后進(jìn)行Tukey’s檢驗(yàn)(b的右圖板，以及d, f)。本圖中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三次。

要點(diǎn)：

腸道PEN2對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的血糖降低效應(yīng)是必需的，PEN2-IKO小鼠在給予二甲雙胍后血糖降低效果減弱。

PEN2對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的肝臟脂肪減少是必需的，肝臟特異性敲除Pen2的小鼠在給予二甲雙胍后肝臟脂肪減少效果減弱。

ATP6AP1對(duì)于二甲雙胍誘導(dǎo)的肝臟脂肪減少是必需的，ATP6AP1–/–小鼠在給予二甲雙胍后肝臟脂肪減少效果減弱。

PEN2和ATP6AP1是二甲雙胍誘導(dǎo)的壽命延長(zhǎng)所必需的，敲低pen-2或ATP6AP1–/–的線蟲(chóng)在給予二甲雙胍后壽命延長(zhǎng)效果減弱。

PEN2和ATP6AP1是飲食中0.1%二甲雙胍誘導(dǎo)的AMPK激活所必需的，PEN2-LKO和ATP6AP1-LKO小鼠在給予含有0.1%二甲雙胍的飼料后肝臟AMPK激活效果減弱。

本圖中的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為三次，以確保結(jié)果的可靠性。

研究結(jié)論

PEN2是二甲雙胍的靶點(diǎn)，通過(guò)與ATP6AP1結(jié)合抑制v-ATPase的活性，激活溶酶體AMPK，從而實(shí)現(xiàn)二甲雙胍的有益效應(yīng)。

PEN2-ATP6AP1軸與溶酶體v-Pase-AXIN-AMPK軸相交，使低濃度的二甲雙胍能夠利用AMP獨(dú)立的AMPK激活途徑，類似于葡萄糖饑餓或卡路里限制。

PEN2-ATP6AP1軸對(duì)于二甲雙胍的三大有益效應(yīng)——餐后血糖降低、肝臟脂肪減少和壽命延長(zhǎng)——是必需的，這些效應(yīng)嚴(yán)格依賴于AMPK。

二甲雙胍通過(guò)促進(jìn)腸道GLP-1的分泌以依賴AMPK的方式降低血糖，但低劑量的二甲雙胍不抑制肝臟糖異生。

PEN2-ATP6AP1軸還參與二甲雙胍抑制mTORC1信號(hào)傳導(dǎo)，但mTORC1的抑制不涉及由AMPK介導(dǎo)的有益效應(yīng)。

二甲雙胍信號(hào)與溶酶體AMPK途徑的交叉，而不干擾AMP/ADP水平，可能是二甲雙胍具有許多益處而副作用較少的原因。

PEN2-ATP6AP1軸為篩選二甲雙胍的替代品提供了潛在目標(biāo)，這可能適用于更廣泛的組織，如肌肉，從而在治療糖尿病和其他代謝疾病方面產(chǎn)生更好的療效。