在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域，生物發(fā)光成像技術(shù)因其高信噪比而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞測定和動物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類有限，限制了同時成像多個分子和細(xì)胞事件的能力。為了突破這一限制，科學(xué)家們開發(fā)了一種新型的ATP非依賴性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經(jīng)過工程改造以增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產(chǎn)生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時間的變化可以用來定量腫瘤生長，甚至在少量血清中也能檢測到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲熒光素酶的結(jié)合使用，為在完整細(xì)胞和活體小鼠中定量TGF-β信號傳導(dǎo)的兩個關(guān)鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開發(fā)中擴(kuò)展了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像能力。NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)時對樣本的侵入性更小，有助于保持細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應(yīng)、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點，使其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報告基因，不僅增強了我們對生物過程的理解和疾病機理的研究，而且在開發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標(biāo)題：Novel NanoLuc Substrates Enable Bright Two-Population Bioluminescence Imaging in Animals

中文標(biāo)題：新型NanoLuc底物實現(xiàn)動物體內(nèi)明亮的雙群體生物發(fā)光成像

發(fā)表期刊：《Nature Methods》

影響因子：36.1

作者單位：

1. Department of Neurobiology, Stanford University, Stanford, CA, USA.

2. Department of Bioengineering, Stanford University, Stanford, CA, USA.

3. Promega Biosciences LLC, San Luis Obispo, CA, USA.

4. Promega Corporation, Madison, WI, USA.

作者信息：Yichi Su, Joel R. Walker, Yunhee Park, Thomas P. Smith, Lan Xiang Liu, Mary P. Hall, Louai Labanieh, Robin Hurst, David C. Wang, Lance P. Encell, Namdoo Kim, Feijie Zhang, Mark A. Kay, Kerriann M. Casey, Robbie G. Majzner, Jennifer R. Cochran, Crystal L. Mackall, Thomas A. Kirkland, Michael Z. Lin

研究背景

生物發(fā)光成像的目標(biāo)是實現(xiàn)體內(nèi)對兩個生物事件的敏感檢測。Antares是一種由NanoLuc熒光素酶和橙色熒光蛋白CyOFP融合而成的明亮生物發(fā)光報告基因，具有與螢火蟲熒光素酶(FLuc)及其衍生物如AkaLuc正交的底物特異性。然而，Antares在老鼠中的亮度受到其底物furimazine溶解度和生物利用度差的限制。生物發(fā)光成像的優(yōu)勢在于無需激發(fā)光，因此在成像過程中不會產(chǎn)生自發(fā)熒光，只有通過自發(fā)底物發(fā)射產(chǎn)生的背景，這對于常用的底物來說是微不足道的，從而可以實現(xiàn)非常高的信噪比，能夠非侵入性地成像深層組織中的細(xì)胞，檢測限低于熒光。為了提高基于NanoLuc的生物發(fā)光成像在動物體內(nèi)的敏感性，提高其底物的溶解性和生物利用度是至關(guān)重要的。研究人員假設(shè)可以通過開發(fā)新的NanoLuc底物來進(jìn)一步提高NanoLuc基底的體內(nèi)生物發(fā)光報告。為此，他們開發(fā)了兩種新的NanoLuc底物：hydrofurimazine (HFz)和fluorofurimazine (FFz)，它們在水性溶液中的溶解度更高，能夠在體內(nèi)產(chǎn)生更高的劑量。這些新型底物能夠在體內(nèi)產(chǎn)生更高的亮度，允許基于Antares的報告基因在深層組織中進(jìn)行高分辨率和長時間的動態(tài)事件追蹤，同時Antares與FFz和AkaLuc與AkaLumine可以用于同一主題的雙生物發(fā)光成像。

研究方法

研究人員首先以furimazine為基礎(chǔ)，通過化學(xué)合成引入極性取代基，開發(fā)出新型NanoLuc底物hydrofurimazine和fluorofurimazine。這些底物具有更高的水溶性和生物利用度，能夠向小鼠體內(nèi)遞送更高劑量。在實驗中，研究人員將這些底物與Antares熒光素酶結(jié)合，通過腹腔注射到表達(dá)Antares的小鼠體內(nèi)，觀察其在肝臟中的亮度表現(xiàn)。結(jié)果顯示，hydrofurimazine在肝臟中的亮度與AkaLuc及其底物AkaLumine相似，而fluorofurimazine在體內(nèi)表現(xiàn)出更高的亮度。此外，研究人員還利用Antares與fluorofurimazine追蹤腫瘤大小，同時使用AkaLuc與AkaLumine可視化CAR-T細(xì)胞，實現(xiàn)了在同一小鼠上對兩種細(xì)胞群體的雙色生物發(fā)光成像。

實驗結(jié)果

圖1：新型furimazine衍生物的體內(nèi)篩選

研究人員對新型furimazine衍生物進(jìn)行了體內(nèi)篩選。首先，展示了這些生物發(fā)光底物的結(jié)構(gòu)及其分子量。接著，使用表達(dá)Antares蛋白的小鼠(具有albumin-Cre和CAG-loxP-stop-loxP-Antares基因)，在肝臟中觀察不同底物注射后的生物發(fā)光情況。實驗結(jié)果以兩種圖像格式展示：左側(cè)為線性偽彩色生物發(fā)光強度圖像疊加在明場圖像上，這是動物生物發(fā)光常用的顯示方式;右側(cè)為原始灰度圖像，直觀地評估相對亮度并可視化解剖特征，盡管這種格式在熒光成像中是標(biāo)準(zhǔn)的，但在動物生物發(fā)光中很少使用。圖像的曝光時間為1秒，像素合并為1，光圈為8。最后，研究人員記錄了不同注射劑量下每種底物的平均生物發(fā)光強度隨時間的變化，并以標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，實驗小鼠的數(shù)量在括號中注明。

圖2：化合物B(HFz)的體內(nèi)表征與應(yīng)用

研究人員對化合物B(HFz)進(jìn)行了詳細(xì)的體內(nèi)表征和應(yīng)用研究。首先，在J:NU小鼠中通過水動力轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入編碼Antares、Antares2、LumiScarlet或AkaLuc的質(zhì)粒，并腹腔注射相應(yīng)熒光素酶的最大量。在最大亮度時間點拍攝的生物發(fā)光圖像顯示了相同的強度標(biāo)度，曝光時間為1秒，像素合并為1，光圈為1.2。接著，研究了不同熒光素酶-底物系統(tǒng)的肝臟平均信號強度隨時間的變化，并以標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，實驗小鼠的數(shù)量在括號中注明。此外，計算了三個系統(tǒng)的平均峰值信號強度，并量化了信號持續(xù)性(以20分鐘時的強度除以峰值強度表示)以及從0到20分鐘的總積分信號。在c-e部分，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，P值通過雙尾Welch不配對t檢驗得出，星號表示P值低于0.0167(根據(jù)Bonferroni方法，三次比較的總體α水平為0.05)時的統(tǒng)計顯著差異。最后，利用Orange CaMBI和延長釋放的化合物B(HFz)對小鼠肝臟中的鈣進(jìn)行生物發(fā)光成像，揭示了肝臟某一區(qū)域的鈣振蕩。原始發(fā)光信號通過擬合單指數(shù)衰減曲線校正底物衰減。頂部的生物發(fā)光圖像顯示了CaMBI活性的局部變化，下方的生物發(fā)光強度顯示了兩個區(qū)域的信號變化，箭頭指示了三個圖像對應(yīng)的時間點。f和g部分的結(jié)果獨立重復(fù)兩次，結(jié)果相似。

圖3：新型氟化furimazine衍生物的體外表征與體內(nèi)篩選

研究人員對新型氟化furimazine衍生物進(jìn)行了體外和體內(nèi)研究。在體外實驗中，展示了氟化furimazine衍生物的結(jié)構(gòu)，并測定了Antares與每種底物的相對kcat和絕對KM的酶動力學(xué)參數(shù)。由于使用相同濃度的純化Antares與每種底物反應(yīng)，相對kcat可以通過相對漸近發(fā)光(Vmax)值計算得出。中心值表示平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，實驗重復(fù)了3次。在體內(nèi)篩選中，使用6-8周齡的表達(dá)Antares蛋白的小鼠(具有albumin-Cre和CAG-loxP-stop-loxP-Antares基因)，注射不同量的氟化furimazine衍生物進(jìn)行生物發(fā)光成像。展示了具有峰值生物發(fā)光的代表性結(jié)果，實驗條件和數(shù)據(jù)處理與圖1b相同，曝光時間為1秒，像素合并為1，光圈為8。最后，記錄了每種注射底物的平均生物發(fā)光強度隨時間的變化，并以標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，實驗小鼠的數(shù)量在括號中注明。

圖4：FFz的體內(nèi)表征與應(yīng)用

研究人員對FFz進(jìn)行了詳細(xì)的體內(nèi)表征和應(yīng)用研究。首先，在未剃毛的白色皮毛小鼠中，測量了新底物、d-熒光素和AkaLumine的背景發(fā)光，實驗獨立重復(fù)兩次，結(jié)果相似。接著，在J:NU裸鼠中通過水動力轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入編碼Antares或AkaLuc的質(zhì)粒，并腹腔注射相應(yīng)熒光素酶的最大量。每種類型的圖像以相同的強度標(biāo)度顯示，并代表最大亮度時間點，曝光時間為1秒，像素合并為1，光圈為1.2。然后，記錄了每種注射底物的平均生物發(fā)光強度隨時間的變化，并以標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，實驗小鼠的數(shù)量在括號中注明。此外，計算了每個系統(tǒng)的平均峰值信號強度和從0到20分鐘的總積分信號。在體外實驗中，測定了轉(zhuǎn)基因HeLa細(xì)胞系中熒光素酶的表達(dá)。最后，在J:NU裸鼠中皮下植入穩(wěn)定表達(dá)Antares和AkaLuc熒光素酶的HeLa細(xì)胞，進(jìn)行生物發(fā)光成像，曝光時間為60秒，像素合并為2，光圈為1.2。

圖5：腫瘤異種移植和CAR-T細(xì)胞的雙色生物發(fā)光成像

研究人員在NSG小鼠中進(jìn)行了腫瘤異種移植和CAR-T細(xì)胞的雙色生物發(fā)光成像實驗。首先，在小鼠的一條腿中植入表達(dá)Antares的MG63.3腫瘤細(xì)胞(第0天)，然后在第14天通過尾靜脈注射表達(dá)AkaLuc的B7-H3 CAR-T細(xì)胞(圖a)或原生T細(xì)胞(圖b)。在指定的天數(shù)，腹腔注射最大量的相應(yīng)熒光素酶底物。接著，對每只小鼠的信號強度進(jìn)行歸一化處理(圖c)。最后，記錄了腫瘤的平均信號強度隨時間的變化，并將其歸一化到腫瘤細(xì)胞注射后的第9天(首次測量時間點)，實驗小鼠數(shù)量為5只，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)誤差，P值通過雙尾Welch不配對t檢驗得出。

研究結(jié)論

研究人員合成了一系列極性取代的furimazine衍生物，其中化合物B(HFz)溶解度最高，作為Antares底物時表現(xiàn)出優(yōu)異的酶促動力學(xué)參數(shù)和穩(wěn)定性。在小鼠模型中，HFz的亮度顯著高于furimazine。進(jìn)一步開發(fā)的氟化底物FFz在體內(nèi)外均表現(xiàn)出更高的亮度和溶解度，且生物發(fā)光半衰期短于HFz。在免疫治療模型中，Antares與FFz和AkaLuc與AkaLumine可用于雙色成像，揭示T細(xì)胞與腫瘤反應(yīng)的關(guān)系。此外，Antares和AkaLuc用于監(jiān)測腫瘤生長和免疫細(xì)胞動態(tài)，其中Antares在FFz作用下信號更強，且在CAR-T細(xì)胞治療中，Antares信號的變化表明腫瘤消退由CAR介導(dǎo)。