基本信息

英文標(biāo)題：Pirin Inhibits FAS‐Mediated Apoptosis to Support Colorectal Cancer Survival

中文標(biāo)題：Pirin抑制FAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以支持結(jié)直腸癌生存

發(fā)表期刊：《Advanced Science》

影響因子：15.1

作者單位：廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

作者信息：Huanhuan Ma, Muhammad Suleman, Fengqiong Zhang, Tingyan Cao, Shixiong Wen, Dachao Sun, Lili Chen, Bin Jiang, Yue Wang, Furong Lin, Jinyang Wang, Boan Li, Qinxi Li.

研究背景

PIR是一個(gè)杯狀超家族蛋白，在人體大多數(shù)組織中廣泛表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PIR與結(jié)直腸癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種癌癥相關(guān)，可能促進(jìn)癌癥生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

PIR是核因子NF??B1的共調(diào)節(jié)因子，可以增強(qiáng)其DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性。PIR還是NRF2的靶標(biāo)，在結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá)，但具體功能尚不清楚。

PIR可以抑制FAS表達(dá)，使癌細(xì)胞逃避FAS介導(dǎo)的凋亡，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞生存能力。

結(jié)直腸癌是一種起源于結(jié)腸或直腸的惡性腫瘤。本文旨在研究PIR在結(jié)直腸癌發(fā)生中的具體生物學(xué)功能和分子機(jī)制。

通過(guò)敲低PIR,研究發(fā)現(xiàn)PIR可以抑制FAS表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)NF??B2而非NF??B1參與其中，提出了PIR-NIK-NF??B2-FAS調(diào)控軸。

通過(guò)該調(diào)控軸，PIR過(guò)表達(dá)可抑制FAS表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)FAS依賴性損傷的抵抗力，尤其是免疫系統(tǒng)的攻擊。

因此，PIR可能成為克服結(jié)直腸癌免疫治療抵抗性的治療靶點(diǎn)。

研究方法

患者和結(jié)直腸癌組織標(biāo)本的獲?。?2對(duì)結(jié)直腸癌組織和相鄰正常組織標(biāo)本。另外，從廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院獲取4對(duì)結(jié)直腸癌組織和相鄰正常組織標(biāo)本，用于免疫組化分析。

細(xì)胞系：使用實(shí)驗(yàn)室保存的HEK293T、HCT116、HT29、MEF、HFF和SW620細(xì)胞系。

抗體和試劑：列出了一些關(guān)鍵抗體和試劑的來(lái)源和標(biāo)識(shí)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：使用裸鼠和C57BL/6小鼠進(jìn)行腫瘤移植和藥物處理實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)過(guò)廈門大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

質(zhì)粒構(gòu)建：擴(kuò)增人類PIR、NF??B2、FAS和RELB的cDNA，通過(guò)PCR方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒感染：使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。利用慢病毒感染法將shRNA質(zhì)粒感染到HCT116細(xì)胞中。

免疫沉淀和西方印跡分析：使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，進(jìn)行免疫沉淀和西方印跡分析。

免疫熒光染色：將細(xì)胞培養(yǎng)在載玻片上，固定、透化、封閉后，進(jìn)行免疫熒光染色。

反轉(zhuǎn)錄定量PCR：提取細(xì)胞RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后進(jìn)行定量PCR分析。

流式細(xì)胞術(shù)：使用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等。

染色質(zhì)免疫沉淀：進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，分析蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。

RNA測(cè)序：對(duì)HCT116細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序，分析基因表達(dá)變化。

統(tǒng)計(jì)分析：使用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：PIR缺失引發(fā)凋亡

A) 使用PIR抗體對(duì)連續(xù)的結(jié)直腸癌組織微陣列進(jìn)行免疫組化染色(左圖)，并分析PIR蛋白表達(dá)強(qiáng)度(右圖)。ColA：結(jié)直腸癌組織;Adj：腫瘤相鄰的正常結(jié)腸組織。標(biāo)尺代表3毫米。數(shù)據(jù)通過(guò)配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析(***p < 0.001, n = 32)。B和C) HCT116細(xì)胞感染表達(dá)shPIR-1的慢病毒以敲低內(nèi)源性PIR，并通過(guò)表達(dá)HA標(biāo)簽的PIR-1(rHA-PIR-1)來(lái)拯救PIR表達(dá)，其shPIR-1靶序列包含同義突變，對(duì)shPIR-1具有抗性。感染96小時(shí)后，通過(guò)FITC/PI染色基于流式細(xì)胞術(shù)確定存活率(C圖)。PIR蛋白通過(guò)西方印跡(WB)檢測(cè)(B圖右)。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并通過(guò)非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析(B圖左，***p < 0.001, n.s.：無(wú)顯著差異)。CTRL：對(duì)照組。D) MEF細(xì)胞按B圖中的方法處理，隨后進(jìn)行免疫染色以顯示色素c和COXIV定位(下板)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(上板)呈現(xiàn)為四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)。細(xì)胞核用DAPI染色。標(biāo)尺代表10微米。Y/G指的是黃色/綠色。E) HCT116細(xì)胞在PIR KD或拯救表達(dá)后分離為細(xì)胞質(zhì)和線粒體部分，隨后檢測(cè)細(xì)胞色素c、GAPDH(作為細(xì)胞質(zhì)對(duì)照)和COXIV(作為線粒體對(duì)照)。F和G) HCT116細(xì)胞(F)和MEF細(xì)胞(G)感染表達(dá)shPIR-1或shPIR-5的慢病毒，隨后用泛胱天蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK處理。感染后72小時(shí)，細(xì)胞用PI染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)存活率(上板)。PIR KD效率通過(guò)WB確定(下板)。結(jié)果呈現(xiàn)為五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.001, n.s.：無(wú)顯著差異)。

圖2：PIR缺失引發(fā)的凋亡是通過(guò)上調(diào)FAS轉(zhuǎn)錄活性介導(dǎo)的

A) 使用MSigDB的標(biāo)準(zhǔn)集合對(duì)本研究中PIR敲低HCT116細(xì)胞的RNA-Seq數(shù)據(jù)中的分化基因進(jìn)行富集分析(|log2FC| ≥ 1, p-value < 0.05)的條形圖。B) 使用GSEA富集分析本研究中HCT116細(xì)胞的RNA-Seq數(shù)據(jù)，尋找凋亡通路的特征簽名。P值通過(guò)GSEA的單尾排列檢驗(yàn)確定。C) 本研究中RNA-Seq數(shù)據(jù)生成的前幾個(gè)上調(diào)的凋亡基因的表達(dá)熱圖。D) PIR敲低組與對(duì)照組相比的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因(DEGs)的火山圖。橫軸代表不同組間基因表達(dá)的log2FoldChange (log2FC)?？v軸代表表達(dá)差異的顯著性水平。DEGs使用limma voom R包計(jì)算。E) 顯示本研究中PIR敲低RNA-Seq數(shù)據(jù)與公開的PIR敲低表達(dá)數(shù)據(jù)集(GSE17551和GSE16798)共享的大部分改變的凋亡基因的維恩圖。F) HCT116細(xì)胞進(jìn)行PIR敲低并進(jìn)一步拯救PIR表達(dá)。PIR敲低48小時(shí)后，提取總RNA，隨后通過(guò)RT-qPCR測(cè)定指示基因的表達(dá)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(n = 5, 非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)表示。G) HCT116細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合敲低PIR-1和FAS。敲低72小時(shí)后，細(xì)胞用PI染色，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行存活分析。數(shù)據(jù)代表五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.001, n.s.：無(wú)顯著差異)。H) 對(duì)HCT116細(xì)胞進(jìn)行WB分析，以確定FAS、PIR、casp8全長(zhǎng)和casp3的蛋白水平，以及PIR敲低或拯救表達(dá)后的casp8和casp3的裂解片段。Casp指的是胱天蛋白酶。I) PIR KO小鼠結(jié)腸中PIR、FAS和裂解Casp3的IHC染色代表性圖像。低倍鏡(1×，左面板)的標(biāo)尺為500微米，高倍鏡(10×，右面板)的標(biāo)尺為50微米。

圖3：NFB2對(duì)于FAS的轉(zhuǎn)錄激活是必需的

A) 進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)，觀察GST、GST-p50或GST-p52對(duì)覆蓋FAS啟動(dòng)子3′-2a區(qū)域的DNA探針的遷移率的影響。探針和蛋白質(zhì)的濃度均為20納米。B) 使用探針3′-2a、GST-p52蛋白和遞增劑量的GST-PIR蛋白進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)。探針的最終濃度為20納米。C) 使用探針3′-2a和指示蛋白進(jìn)行凝膠遷移實(shí)驗(yàn)。探針的最終濃度為20納米。D) 在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Flag標(biāo)簽的PIR和HA標(biāo)簽的RELB。使用抗Flag瓊脂糖(Flag IP)進(jìn)行共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，隨后在免疫沉淀物中檢測(cè)Flag-PIR和HA-RELB。E) 使用內(nèi)源性蛋白質(zhì)進(jìn)行共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以確定PIR與RELB在HCT116細(xì)胞中的相互作用。F) 在HEK293T細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Flag-PIR、Flag-RELB和HA-p52。進(jìn)行共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以確定PIR是否干擾RELB和p52的相互作用。G) 在HCT116細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Flag-RELB和Flag-p52，隨后用shPIR敲低PIR并進(jìn)一步用rHA-PIR拯救PIR。然后進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)，使用抗Flag抗體確定p52/RELB與FAS啟動(dòng)子的結(jié)合。H) 在HCT116細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Flag-RELB和Flag-p52，隨后用DMSO或TphA (50微米，12小時(shí))處理。然后按照G中的方法進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。I) 首先在HCT116細(xì)胞中分別表達(dá)shGFP(作為對(duì)照)和shNF??B2，以創(chuàng)建NF??B1敲低的細(xì)胞系。24小時(shí)后，每組細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)shGFP或shPIR-1。再培養(yǎng)72小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞的存活率(上板)和通過(guò)西方印跡檢測(cè)指示蛋白的表達(dá)水平(下板)。數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 5，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，**p < 0.01, ***p < 0.001)。J) 在HCT116細(xì)胞中轉(zhuǎn)染指示的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，評(píng)估細(xì)胞的存活率(上板)和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平(下板)。數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 4，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.001)。K) 在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染攜帶FAS全長(zhǎng)啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(FAS-Luc)或其3′-2a缺失突變體(FAS-3′-2a-Luc)，以及不同劑量的Flag-p52/RELB復(fù)合物。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，測(cè)定熒光素酶活性并歸一化到第一列(上板)。通過(guò)西方印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)水平(下板)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n = 3，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，**p < 0.01, ***p < 0.001, n.s.：無(wú)顯著差異)。

圖4：PIR抑制FAS膜轉(zhuǎn)位和NF??B2激活

A) HCT116細(xì)胞在預(yù)先拯救表達(dá)HA-PIR與否的情況下敲低PIR。48小時(shí)后，檢測(cè)指示蛋白的表達(dá)。B) HCT116細(xì)胞分別用10微米的PIR抑制劑CCG-1423和CCG-203971處理12小時(shí)，然后檢測(cè)指示蛋白。C) 建立條件性PIR敲除(cKO)小鼠的策略的簡(jiǎn)化描述。D) 通過(guò)在來(lái)自PIR cKO小鼠的原代MEF細(xì)胞中表達(dá)腺病毒基礎(chǔ)的Cre重組酶創(chuàng)建PIR KO MEFs，并檢測(cè)指示蛋白。E) 在Cre-Ad處理后第七天，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)生成的PIR KO MEFs的存活率。F) 顯示與E中相同的PIR KO MEFs的形態(tài)。G) HCT116、HT29、CT26和MEF細(xì)胞在有無(wú)抗FAS-mAb(HCT116和HT29細(xì)胞為2.5微克/毫升，CT26和MEF細(xì)胞為10微克/毫升)處理24小時(shí)后，檢測(cè)指示蛋白。H) 在HCT116細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)HA-PIR，并使用抗HA進(jìn)行共免疫沉淀，以確定HA-FAS與內(nèi)源性PIR的關(guān)聯(lián)。E2F1作為陰性對(duì)照。I) 進(jìn)行免疫熒光染色，以確定Flag-FAS(綠色)和HA-PIR(紅色)在MEFs中的共定位。標(biāo)尺代表50微米。J) 在MEFs中過(guò)表達(dá)HA-FAS，有無(wú)PIR敲低，隨后進(jìn)行FAS的免疫熒光(IF)染色(綠色)。細(xì)胞核(藍(lán)色)用DAPI染色。標(biāo)尺，10微米。K) HCT116細(xì)胞在預(yù)先拯救表達(dá)HA-PIR與否的情況下敲低PIR。48小時(shí)后，用抗FAS-PE染色，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定膜分布的FAS。右側(cè)顯示相對(duì)PE熒光強(qiáng)度的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.01, n.s.：無(wú)顯著差異)。

圖5：PIR抑制減弱結(jié)直腸癌的形成

A) 根據(jù)FAS和PIR的平均表達(dá)水平，將患者數(shù)據(jù)分為4組，繪制Kaplan-Meier生存曲線。數(shù)據(jù)來(lái)源于Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。B) 將野生型(ctrl)和shPIR-1 HCT116細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞)分別皮下注射到裸鼠的左右兩側(cè)，觀察4周內(nèi)的移植瘤形成。切除的腫瘤(左上)稱重，并通過(guò)非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析(右，n = 4)。相應(yīng)腫瘤中的指示蛋白通過(guò)西方印跡檢測(cè)(左下)。C) 顯示了使用PIR抑制劑CCG-1423治療移植瘤的程序示意圖。簡(jiǎn)而言之，8只裸鼠在左右兩側(cè)皮下注射107個(gè)HCT116細(xì)胞。小鼠隨機(jī)分為兩組。一周后，小鼠每周三次靜脈注射PBS(對(duì)照組)或PIR抑制劑CCG-1423(每次10毫克/千克)。在第15天、第20天和第25天測(cè)量腫瘤體積。s.c.：皮下注射;i.v.：靜脈注射。D) 顯示了(C)中對(duì)照組和CCG-1423處理組的腫瘤體積，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過(guò)非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)。E) 顯示了分別用溶劑和CCG-1423處理的裸鼠的代表性移植瘤圖片(左面板)。切除的腫瘤(中間)稱重，并通過(guò)Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析(右面板，n = 8, **p < 0.01)。F) AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌小鼠模型的簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)。G和H) 顯示了野生型和PIR敲除小鼠的代表性結(jié)腸圖片(G)以及腫瘤數(shù)量的計(jì)算和分析(H, n = 5, ****p < 0.0001)。I) 結(jié)腸組織的代表性病理學(xué)圖片。低倍鏡(1×，左面板)的標(biāo)尺為500微米，高倍鏡(10×，右面板)的標(biāo)尺為50微米。J) 通過(guò)西方印跡檢測(cè)野生型或PIR敲除結(jié)腸組織中的指示蛋白水平。

圖6：PIR抑制使細(xì)胞對(duì)FAS為基礎(chǔ)的免疫治療敏感

A) HCT116細(xì)胞感染空白載體病毒或不同體積的shPIR-1病毒。感染后24小時(shí)，細(xì)胞用抗FAS-mAb (2.5 μg mL?1)處理24小時(shí)。然后通過(guò)PI染色確定存活率。數(shù)據(jù)代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3, **p < 0.01, n.s.：無(wú)顯著差異，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn))。PIR蛋白水平顯示在下面板。

B) HT29細(xì)胞用空白載體病毒(CTRL)或PIR KD病毒處理。感染后24小時(shí)，細(xì)胞用抗FAS-mAb (2.5 μg mL?1)處理24小時(shí)，隨后檢測(cè)存活率(n = 5, 非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.001)。C) 創(chuàng)建了敲低FAS或不同水平PIR的HCT116細(xì)胞系，標(biāo)記為GFP，并與預(yù)先活化的成人CD8+ T細(xì)胞共孵育20小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定HCT116細(xì)胞的存活率。條形圖(上板)代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.001, n.s.：無(wú)顯著性)。PIR和FAS蛋白通過(guò)西方印跡檢測(cè)(下板)。D) 結(jié)直腸癌中不同PIR和FAS表達(dá)狀態(tài)的腫瘤中各種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的箱形圖。P值通過(guò)Student’s t檢驗(yàn)分析。數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。HH：PIR高表達(dá)和FAS高表達(dá);HL：PIR高表達(dá)和FAS低表達(dá);LH：PIR低表達(dá)和FAS高表達(dá);LL：PIR低表達(dá)和FAS低表達(dá)。

圖7：PIR通過(guò)關(guān)閉NF-??B2-FAS軸抑制FAS依賴性凋亡

A) CT26細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合使用西妥昔單抗(CTX，10微克/毫升)和TphA (50微克/毫升)處理24小時(shí)，隨后檢測(cè)存活率(上板，n = 5，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，***p < 0.001)和FAS蛋白水平(下板)。

B和C) 根據(jù)B圖上板的程序，使用小鼠CT26細(xì)胞進(jìn)行同種異體移植瘤實(shí)驗(yàn)。小鼠在第24天被犧牲。展示了單獨(dú)或聯(lián)合使用CTX和TphA處理的鼠標(biāo)在 situ腫瘤(B)和轉(zhuǎn)移性腸道腫瘤(C)的代表性圖片。s.c.：皮下注射;i.p.：腹腔注射。標(biāo)尺代表5毫米。D) 顯示了(B)和(C)中相同小鼠的結(jié)腸腫瘤數(shù)量(左板)和腫瘤負(fù)荷的結(jié)腸(右板)(n = 5，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，**p < 0.01)。E和F) 對(duì)CD8+ T細(xì)胞的百分比進(jìn)行定量分析(E，n = 5，非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)，*p < 0.05, ***p < 0.001)。使用CD8+ T細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行免疫組化染色，以確定在 situ腫瘤中的CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)(F)。標(biāo)尺分別代表200微米和20微米。

研究結(jié)論

FASL和FAS長(zhǎng)期被認(rèn)為是扮演著在免疫清除癌細(xì)胞中重要角色的死亡系統(tǒng)。

IL-2激活的CD8+ T淋巴細(xì)胞通過(guò)啟動(dòng)FASL/FAS凋亡途徑，作為消除癌細(xì)胞的主要執(zhí)行者。

癌細(xì)胞內(nèi)源性的FAS蛋白表達(dá)及其隨后向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，是CD8+ T淋巴細(xì)胞執(zhí)行FASL觸發(fā)的凋亡的決定因素。

本研究揭示了PIR蛋白在保護(hù)癌細(xì)胞免受CD8+殺傷T細(xì)胞執(zhí)行凋亡方面的 ● previously undefined role(先前未定義的作用)。

PIR通過(guò)破壞FAS轉(zhuǎn)錄活性和阻斷FAS膜轉(zhuǎn)位(圖S7A，支持信息)，在多個(gè)方面抑制FAS依賴性凋亡。

研究的關(guān)鍵點(diǎn)在于內(nèi)源性FAS蛋白表達(dá)及其向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位對(duì)CD8+ T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的凋亡的重要性。

PIR蛋白通過(guò)兩種方式抑制NF??B2介導(dǎo)的FAS轉(zhuǎn)錄活性。

PIR促進(jìn)NIK的蛋白酶體降解，NIK是NF??B2的上游激酶，整合TNF受體家族成員的信號(hào)并激活NF??B2成熟(從幼稚的p100到成熟的p52)和核轉(zhuǎn)位。

PIR與RELB相互作用，破壞NF??B2復(fù)合物(p52-RELB)與FAS啟動(dòng)子的結(jié)合，從而阻斷NF??B2對(duì)FAS的轉(zhuǎn)錄活性。

PIR通過(guò)與FAS相互作用并將其保留在細(xì)胞質(zhì)中，阻止其膜轉(zhuǎn)位，進(jìn)一步抑制FAS表達(dá)。

FAS mAb觸發(fā)的FAS激活也能誘導(dǎo)NIK和FAS表達(dá)，建立FAS激活和NIK介導(dǎo)的● NF??B2介導(dǎo)的FAS表達(dá)之間的正反饋循環(huán)。

PIR的過(guò)量表達(dá)可能破壞這種FAS信號(hào)的自動(dòng)放大。

本研究建立了PIR-NIK-NF??B2-FAS生存信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并表明PIR是抑制FAS依賴性凋亡、促進(jìn)CRC惡性的重要生存因子。

PIR在CRC中抑制FAS表達(dá)，并通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)CRC惡性。

目前尚不清楚這些機(jī)制是否特限于CRC或CRC特異性。

研究還提供了令人信服的證據(jù)，證明PIR可能是CRC治療的新興靶點(diǎn)。

PIR敲低或抑制劑處理導(dǎo)致的內(nèi)源性FAS上調(diào)可以顯著觸發(fā)凋亡，即使沒(méi)有上游啟動(dòng)子的刺激。

PIR抑制劑可以顯著減緩HCT116細(xì)胞的小鼠移植瘤生長(zhǎng)。

PIR表達(dá)與NIK和FAS表達(dá)以及生存率呈負(fù)相關(guān)，這支持了PIR作為CRC治療靶點(diǎn)的建議。

PIR抑制可能是一種有希望的CRC治療策略，特別是對(duì)于PIR水平高、FAS水平低的CRC。

PIR抑制劑與免疫檢查點(diǎn)阻斷聯(lián)合使用可能是一種治療CRC的潛在策略，特別是對(duì)于那些對(duì)免疫治療耐藥的CRC。

開發(fā)更有效的PIR抑制劑是未來(lái)的緊迫任務(wù)。