Fluc細(xì)胞是經(jīng)過(guò)基因工程改造后能夠表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶的細(xì)胞，因其高靈敏度、低背景干擾、蛋白穩(wěn)定性強(qiáng)和耐熱性而在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)中被廣泛應(yīng)用。這些細(xì)胞不僅能夠用于驗(yàn)證miRNA與mRNA、lncRNA、circRNA之間的相互作用，還能動(dòng)態(tài)監(jiān)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，以及研究CAR-T細(xì)胞治療的效果。Fluc細(xì)胞的高靈敏度和穩(wěn)定性減少了對(duì)樣本的侵入性，保持了細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)，而其快速反應(yīng)和低背景發(fā)光特性，預(yù)示著在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)luc細(xì)胞的應(yīng)用將進(jìn)一步擴(kuò)展，為疾病研究和治療提供更多可能性。

基本信息

英文標(biāo)題：A Chemerin Peptide Analog Stimulates Tumor Growth in Two Xenograft Mouse Models of Human Colorectal Carcinoma

中文標(biāo)題：Chemerin肽類似物促進(jìn)兩種人類結(jié)直腸癌異種移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)

發(fā)表期刊：《Cancers》

影響因子：6.6

作者單位：

1. Department of Hepatology and Gastroenterology, Charité—University Medicine Berlin, Corporate Member of Free University Berlin and Humboldt University Berlin, 13353 Berlin, Germany

2. Department of Nephrology, University Hospital Essen, University Duisburg-Essen, 45127 Essen, Germany

3. Partner Site Berlin, German Cancer Consortium (DKTK), 13353 Berlin, Germany

4. German Cancer Research Center (DKFZ), 69120 Heidelberg, Germany

作者信息：

Justa Friebus-Kardash, Petra Schulz, Sandy Reinicke, Cordula Karthaus, Quirino Schefer, Sebastian Bandholtz, Carsten Gr?tzinger

研究背景

Chemerin的血漿濃度已被報(bào)道與結(jié)直腸癌(CRC)的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。然而，Chemerin在CRC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中的潛在調(diào)控作用尚未在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行研究。本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型探討Chemerin類似物CG34對(duì)CRC細(xì)胞系的增殖、集落形成和遷移的影響，以驗(yàn)證這一假設(shè)。研究結(jié)果表明，盡管CG34對(duì)三種CRC細(xì)胞系的單層增殖沒(méi)有明顯的刺激作用，但它促進(jìn)了三維聚集體中的集落形成，并且對(duì)細(xì)胞遷移沒(méi)有影響。在治療研究中，CG34顯著刺激了HCT116-luc和HT29-luc異種移植瘤的生長(zhǎng)和生物發(fā)光信號(hào)。這些發(fā)現(xiàn)首次表明Chemerin信號(hào)在CRC中具有刺激腫瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。

研究方法

本研究采用了一系列實(shí)驗(yàn)方法來(lái)評(píng)估Chemerin類似物CG34對(duì)結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞增殖、集落形成和遷移的影響。

實(shí)驗(yàn)包括

1) 使用RT-qPCR技術(shù)分析RNA表達(dá)；

2) 通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的Chemerin；

3) 利用DAPI染色和Bright-Field顯微鏡評(píng)估細(xì)胞增殖；

4) 通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在三維條件下的生長(zhǎng)；

5) 使用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移；

6) 在HCT116-luc和HT29-luc異種移植小鼠模型中進(jìn)行CG34治療研究，監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)和生物發(fā)光信號(hào)；

7) 通過(guò)CD31和Ki67免疫組化染色分析腫瘤血管密度和增殖活性。這些方法綜合評(píng)估了CG34對(duì)CRC細(xì)胞行為的影響，并在體內(nèi)外模型中進(jìn)行了驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：人結(jié)直腸及其他癌細(xì)胞系中Chemerin信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的定量分析

通過(guò)定量RT-qPCR測(cè)定的人結(jié)直腸及其他癌細(xì)胞系中CMKLR1、GPR1、CCRL2和Chemerin(RARRES2)mRNA的表達(dá)。(A) CMKLR1;(B) GPR1;(C) CCRL2;(D) Chemerin(RARRES2)。上圖部分表示腫瘤起源的器官;細(xì)胞系名稱在底部提供。數(shù)據(jù)已標(biāo)準(zhǔn)化至參考基因UBC、ALG9和GAPDH。圖中的1值對(duì)應(yīng)于cq值為34。所有數(shù)據(jù)表示為2-5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差;n.d. = 未檢測(cè)到mRNA。

圖2："結(jié)直腸癌及其他癌細(xì)胞系分泌Chemerin肽的定量分析"

"結(jié)直腸癌及其他癌細(xì)胞系分泌Chemerin肽的量通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的濃度。細(xì)胞在大約70%的密度下培養(yǎng);在24小時(shí)孵育后收集上清液。上圖部分表示腫瘤起源的器官;細(xì)胞系名稱在底部提供。所有數(shù)據(jù)表示為2-6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了雙重測(cè)定"。

圖3：CG34對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖影響的體外實(shí)驗(yàn)分析

Chemerin肽類似物CG34對(duì)三種熒光素酶表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116-luc、HT29-luc、SW620-luc)體外增殖的影響，通過(guò)與低血清培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)和高血清培養(yǎng)基(陽(yáng)性對(duì)照)的終點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(IN Cell高含量分析DAPI染色細(xì)胞核，上圖A-D)以及與對(duì)照組(僅培養(yǎng)基)的動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)(使用Incucyte活細(xì)胞顯微鏡測(cè)量細(xì)胞匯合度，下圖E-H)進(jìn)行比較。圖A展示了模式識(shí)別算法檢測(cè)DAPI染色細(xì)胞核的示例圖像(比例尺：50微米);定量結(jié)果分別為圖B的HCT116-luc、圖C的HT29-luc和圖D的SW620-luc。圖E展示了五天內(nèi)活細(xì)胞顯微鏡實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)結(jié)果(黑色：對(duì)照細(xì)胞，紅色：CG34處理細(xì)胞)。定量結(jié)果分別為圖F的HCT116-luc、圖G的HT29-luc和圖H的SW620-luc。所有數(shù)據(jù)表示為3次(DAPI細(xì)胞核計(jì)數(shù))或5次(動(dòng)態(tài)顯微鏡獨(dú)立實(shí)驗(yàn))的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖4：CG34對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系集落形成和遷移能力的影響

Chemerin肽類似物CG34與對(duì)照組(僅有培養(yǎng)基)對(duì)三種熒光素酶表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系(HCT116-luc、HT29-luc、SW620-luc)的集落形成和遷移的影響。(A) 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果。集落形成數(shù)據(jù)表示為3-4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。統(tǒng)計(jì)顯著性通過(guò)非配對(duì)t檢驗(yàn)確定;* p < 0.05, ** p < 0.01。(B) 治療開(kāi)始時(shí)(0小時(shí))遷移實(shí)驗(yàn)的示例圖像。(C) 與(B)相同的孔在20小時(shí)后拍攝的圖像。(D-F) 遷移實(shí)驗(yàn)的定量結(jié)果：(D) HCT116-luc;(E) HT29-luc;(F) SW620-luc。遷移數(shù)據(jù)表示為4次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)九次。

圖5：CG34對(duì)人類結(jié)直腸癌異種移植小鼠模型生長(zhǎng)的影響

展示了Chemerin肽類似物CG34對(duì)兩種人類結(jié)直腸癌異種移植小鼠模型(HCT116-luc和HT29-luc)生長(zhǎng)的影響。研究中，將表達(dá)熒光素酶的HCT116-luc和HT29-luc細(xì)胞接種到雌性NMRI裸鼠體內(nèi)，從接種后第8天開(kāi)始，對(duì)小鼠進(jìn)行為期21天的CG34或水的腹腔注射治療。實(shí)驗(yàn)期間，每周監(jiān)測(cè)腫瘤體積和生物發(fā)光信號(hào)，最終在第28天結(jié)束治療后，通過(guò)卡尺測(cè)量和生物發(fā)光成像儀記錄數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)犧牲的小鼠進(jìn)行腫瘤體積和重量的測(cè)量，以評(píng)估CG34對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。所有數(shù)據(jù)均為每組6個(gè)腫瘤的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差或標(biāo)準(zhǔn)差，并通過(guò)非配對(duì)t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證，以確定CG34治療的顯著性。

圖6：異種移植腫瘤治療后血管密度和增殖活性的免疫組化分析

圖展示了在完成圖5所示的治療研究后，對(duì)異種移植腫瘤組織切片進(jìn)行的免疫組化分析和定量研究，以評(píng)估血管密度(通過(guò)CD31染色)和腫瘤細(xì)胞的增殖活性(通過(guò)Ki67染色)。這些定量數(shù)據(jù)基于15-24個(gè)顯微鏡視野的分析，結(jié)果顯示了平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。為了確定治療組與對(duì)照組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用了非配對(duì)t檢驗(yàn)，其中*表示p值小于0.05，表示差異顯著。圖像中的比例尺為50微米，以供參考。

研究結(jié)論

研究結(jié)論表明，Chemerin信號(hào)通路在結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞系中具有不同的表達(dá)水平，且Chemerin類似物CG34在體外能顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞系的集落形成，而在體內(nèi)動(dòng)物模型中，CG34處理的腫瘤體積和生物發(fā)光強(qiáng)度高于對(duì)照組，表明CG34可能促進(jìn)了腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖。