同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(xué)(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問題，研究人員通過將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達(dá)到同源異體腫瘤細(xì)胞中，開發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細(xì)胞系更慢的腫瘤生長(zhǎng)速度，這可能是由于免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達(dá)的模型對(duì)ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們?cè)谠鰪?qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過過繼T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，研究人員驗(yàn)證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細(xì)胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細(xì)胞不僅增強(qiáng)了對(duì)ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評(píng)估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對(duì)于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標(biāo)題：Targeting CD73 Enhances the Antitumor Activity of Anti-PD-1 and Anti-CTLA-4 mAbs.

中文標(biāo)題：靶向CD73增強(qiáng)抗PD-1和抗CTLA-4單克隆抗體的抗腫瘤活性

發(fā)表期刊：《Clin Cancer Res》

影響因子：11.4

作者單位：

1.Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Universite de Montréal, Faculté de Pharmacie et Institut du Cancer de Montréal, Montréal, Québec, Canada

2.Cancer Immunology Program, Trescowthick Laboratories, Peter MacCallum Cancer Centre, St. Andrews Place, East Melbourne

3.Sir Peter MacCallum Department of Oncology, University of Melbourne, Parkville, Victoria

4.Immunology in Cancer and Infection Laboratory, Queensland Institute of Medical Research

5.School of Medicine, University of Queensland, Herston, Queensland, Australia

作者信息：Bertrand Allard, Sandra Pommey, Mark J. Smyth, John Stagg.

研究背景

阻斷程序性死亡(PD)-1或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原(CTLA-4)受體的單克隆抗體(mAb)與多種癌癥類型的持久臨床反應(yīng)相關(guān)，并作為新型癌癥治療藥物展現(xiàn)出巨大潛力。近期證據(jù)表明，針對(duì)多個(gè)免疫抑制途徑的靶向阻斷可誘導(dǎo)協(xié)同抗腫瘤反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)方法：本研究使用MC38-OVA、RM-1和4T1.2腫瘤細(xì)胞系，以及野生型C57Bl/6、BALB/c、IFN-γ缺陷和穿孔素缺陷C57Bl/6小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用了多種抗體和化學(xué)品，包括抗CD73、抗PD-1、抗CTLA-4單克隆抗體等。MC38-OVA和RM-1腫瘤細(xì)胞皮下注射到C57Bl/6小鼠中，小鼠接受抗CD73、抗PD-1、抗CTLA-4單克隆抗體或?qū)φ誌g處理。為了評(píng)估T細(xì)胞的作用，小鼠還接受抗CD4和抗CD8b單克隆抗體處理。對(duì)于生存實(shí)驗(yàn)，4T1.2腫瘤細(xì)胞接種到BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中，腫瘤切除后進(jìn)行處理。通過流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，使用定量實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)腫瘤組織中的基因表達(dá)。此外，還通過3-甲基膽蒽誘導(dǎo)C57Bl/6小鼠產(chǎn)生纖維肉瘤，評(píng)估不同抗體處理的效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：抗CD73單克隆抗體增強(qiáng)抗PD-1和抗CTLA-4單克隆抗體的抗腫瘤活性

野生型(A和D)、IFN-γ缺陷(B和E)或穿孔素缺陷(C和F)C57Bl/6小鼠皮下注射MC38-OVA腫瘤細(xì)胞(10^6個(gè)細(xì)胞)，并在第12天、第16天和第20天接受腹腔注射抗CD73單克隆抗體(100 mg，克隆TY/23)、抗PD-1單克隆抗體(100 mg，克隆RMP1-14)、抗CTLA-4單克隆抗體(100 mg，克隆UC10-4F10)、抗CD73/抗PD-1單克隆抗體(各100 mg，腹腔注射;A-C)或抗CD73/抗CTLA-4單克隆抗體(各100 mg，腹腔注射;D-F)，或?qū)φ誌g(200 mg，腹腔注射)。每組5只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)如圖所示(*P < 0.05，Mann–Whitney檢驗(yàn)，聯(lián)合治療與單一藥物治療之間)。圖中顯示的是2次實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性結(jié)果。

圖2：抗CD73單克隆抗體增強(qiáng)抗PD-1和抗CTLA-4單克隆抗體誘導(dǎo)的Th1反應(yīng)

A部分，野生型C57Bl/6小鼠皮下注射MC38-OVA腫瘤細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞)，并在第12天和第15天接受腹腔注射抗CD73單克隆抗體(100 mg，克隆TY/23)、抗PD-1單克隆抗體(100 mg，克隆RMP1-14)、抗CTLA-4單克隆抗體(100 mg，克隆9H10)、抗CD73/抗PD-1單克隆抗體(各100 mg)或抗CD73/抗CTLA-4單克隆抗體(各100 mg)，或?qū)φ誌g(200 mg)。第18天，通過流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤單細(xì)胞懸液的CD8表達(dá)和四聚體反應(yīng)性(Tet)。每組5只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)如圖所示(*P < 0.05，Mann–Whitney檢驗(yàn))。

B部分，通過實(shí)時(shí)PCR分析治療后腫瘤中IFN-γ和T-bet(Tbx21)mRNA的表達(dá)。每組4只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)如圖所示(*P < 0.05，Mann–Whitney檢驗(yàn))。C和D部分，分別顯示了經(jīng)腹腔注射抗CD73單克隆抗體或?qū)φ誌g處理的MC38-OVA荷瘤小鼠中TIL(腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)群體中CD73表達(dá)的百分比(C)和平均熒光強(qiáng)度(MFI;D)。使用不同的抗CD73單克隆抗體進(jìn)行阻斷(克隆TY/23)和流式細(xì)胞術(shù)(TY/11.8)。每組5只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)如圖所示(***P < 0.001，Mann–Whitney檢驗(yàn))。

圖3：抗CD73單克隆抗體聯(lián)合抗PD-1或抗CTLA-4單克隆抗體治療已建立的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的療效

將5萬4T1.2腫瘤細(xì)胞接種到野生型BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中，第25天切除原發(fā)腫瘤，第28、32、36和40天用100 mg抗CD73單克隆抗體(TY/23)、抗PD-1單克隆抗體(RMP1-14)和/或抗CTLA-4單克隆抗體(UC10-4F10)進(jìn)行治療。通過log-rank(Mantel–Cox)檢驗(yàn)評(píng)估各組間生存差異的顯著性(P < 0.0001)。

具體比較結(jié)果如下：

a. 抗CD73與抗PD-1/抗CD73或抗CD73/抗CTLA-4比較：log-rank檢驗(yàn)P = 0.0002，Gehan–Breslow–Wilcoxon(GBW)檢驗(yàn)P = 0.002。

b. 抗CTLA-4與抗CD73/抗CTLA-4比較：log-rank檢驗(yàn)P = 0.0027，GBW檢驗(yàn)P = 0.0043。

c. 抗PD-1與抗PD-1/抗CD73比較：log-rank檢驗(yàn)P = 0.0027，GBW檢驗(yàn)P = 0.0043。

d. 抗PD-1/抗CD73與抗CD73/抗CTLA-4比較：log-rank檢驗(yàn)P = 0.0018，GBW檢驗(yàn)P = 0.0039。

圖4：聯(lián)合抗CD73/抗PD-1單克隆抗體治療抑制致癌物誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生

C57Bl/6小鼠在后肢皮下接種400 mg的3-甲基膽蒽(MCA)。一旦腫瘤形成(0.24–0.39 cm2)，小鼠接受以下處理：

(A) 腹腔注射對(duì)照Ig(100 mg)

(B) 腹腔注射抗CD73單克隆抗體(100 mg，克隆TY/23)

(C) 腹腔注射抗PD-1單克隆抗體(100 mg，克隆RMP1-14)

(D) 聯(lián)合抗CD73/抗PD-1單克隆抗體(各100 mg)，每周兩次，持續(xù)6周

在300天內(nèi)每周監(jiān)測(cè)纖維肉瘤的發(fā)展。圖中顯示了每只小鼠的腫瘤大小。

圖5：GP-M30在B16F10黑色素瘤模型中誘導(dǎo)了針對(duì)B16F10新抗原M30的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和抗腫瘤活性

野生型或CD73缺陷C57Bl/6小鼠皮下注射MC38-OVA腫瘤細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞)，并在第12天和第15天接受泛腺苷受體激動(dòng)劑NECA(0.05 mg/kg 腹腔注射+0.05 mg/kg 皮下注射)和/或A2A腺苷受體拮抗劑SCH58261(1 mg/kg)處理。第18天，分析腫瘤細(xì)胞懸液。A部分，流式細(xì)胞術(shù)(FACS)點(diǎn)圖顯示腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+ T細(xì)胞(左)和CD8+ Tet+ T細(xì)胞上PD-1表達(dá)水平的直方圖(右)。B和C部分，分別顯示卵清蛋白特異性CD8+ T細(xì)胞(B)和CD4+ Foxp3+ T細(xì)胞(C)上PD-1(左)和CTLA-4(右)表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。每組5只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)如圖所示(*P < 0.05，Mann–Whitney檢驗(yàn))。D部分，C57Bl/6小鼠脾臟T細(xì)胞在體外激活，48小時(shí)后用NECA+ SCH58261處理。激活后24、48和72小時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量CD4+和CD8+ T細(xì)胞上的PD-1和CTLA-4表達(dá)水平(MFI)。

研究結(jié)論

本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)探討了CD73阻斷對(duì)抗PD-1和抗CTLA-4單克隆抗體治療效果的增強(qiáng)作用。在MC38-OVA腫瘤模型中，抗CD73和抗PD-1單克隆抗體的聯(lián)合治療顯著延遲了腫瘤生長(zhǎng)，并在所有處理小鼠中誘導(dǎo)了完全腫瘤排斥。這種抗腫瘤活性依賴于IFN-γ，而與穿孔素?zé)o關(guān)。類似地，抗CD73單克隆抗體也顯著增強(qiáng)了抗CTLA-4單克隆抗體的治療效果，但未誘導(dǎo)完全腫瘤回歸。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療增加了腫瘤浸潤(rùn)的抗原特異性CD8+ T細(xì)胞，并上調(diào)了Th1免疫基因Tbx21和IFN-γ的表達(dá)。此外，抗CD73單克隆抗體治療顯著下調(diào)了TILs上的CD73表達(dá)。在4T1.2乳腺癌模型中，聯(lián)合抗CD73和抗PD-1或抗CTLA-4單克隆抗體顯著延長(zhǎng)了小鼠的生存期。在MCA誘導(dǎo)的纖維肉瘤模型中，聯(lián)合治療顯著延遲了腫瘤進(jìn)展，并在部分小鼠中誘導(dǎo)了完全或部分腫瘤回歸。最后，研究發(fā)現(xiàn)A2A腺苷受體的激活上調(diào)了TILs上的PD-1表達(dá)，而抗CD73單克隆抗體處理未改變TILs上的PD-1或CTLA-4水平，表明CD73阻斷與抗PD-1單克隆抗體之間存在非冗余的協(xié)同機(jī)制。