乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，有超過2.5億人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我國(guó)，人數(shù)接近1億人。NTCP工具細(xì)胞，特別是外源表達(dá)NTCP的肝癌細(xì)胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重現(xiàn)性佳的特點(diǎn)，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演著至關(guān)重要的角色。這些細(xì)胞模型能夠有效模擬HBV的感染過程，為研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒復(fù)制以及藥物篩選提供了一個(gè)強(qiáng)大而便捷的體外平臺(tái)。它們不僅有助于揭示HBV感染的分子機(jī)制，如DDX3作為宿主限制因子阻礙cccDNA轉(zhuǎn)錄，GPC5作為附著因子在感染入胞過程中的作用，還能通過直接與NTCP相互作用或下調(diào)NTCP表達(dá)來篩選和驗(yàn)證抗病毒藥物的活性，例如環(huán)孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，這些工具細(xì)胞還促進(jìn)了對(duì)HBV宿主特異性分子的發(fā)現(xiàn)，為發(fā)展支持HBV感染的小動(dòng)物模型提供了可能，這對(duì)于乙肝相關(guān)研究和藥物開發(fā)具有重大意義。

基本信息

英文標(biāo)題：CRISPR Technique Incorporated with Single-Cell RNA Sequencing for Studying Hepatitis B Infection

中文標(biāo)題：利用CRISPR技術(shù)與單細(xì)胞RNA測(cè)序研究乙型肝炎感染

發(fā)表期刊：《Analytical Chemistry》

影響因子：6.7

作者單位：

1.Li Ka Shing Institute of Virology, Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2E1

2.Division of Analytical and Environmental Toxicology, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2G3

3.High Content Analysis Core Facility, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2R3

作者信息：

Connie Le, Yanming Liu, Joaquín López-Orozco, Michael A. Joyce, X. Chris Le, D. Lorne Tyrrell

研究背景

單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)在研究分子事件和細(xì)胞異質(zhì)性方面表現(xiàn)出色，尤其在SARS-CoV-2感染研究中，揭示了病毒引起的免疫細(xì)胞變化和感染動(dòng)力學(xué)。然而，其在富集低豐度基因方面存在挑戰(zhàn)。本研究旨在開發(fā)一種利用CRISPR技術(shù)的選擇性富集技術(shù)，以改善這一問題。該技術(shù)通過切割大量宿主轉(zhuǎn)錄本，選擇性擴(kuò)增低豐度序列，便于后續(xù)高通量測(cè)序。研究聚焦于感染HBV的肝細(xì)胞，HBV是全球肝病死亡的主要原因之一，其感染機(jī)制尚未完全闡明。本研究利用CRISPR-Cas9技術(shù)耗竭高豐度基因，優(yōu)先富集HBV轉(zhuǎn)錄本，以期為HBV感染研究提供新方法。

研究方法

本研究中，先用含4%成人血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Huh7.5-NTCP細(xì)胞并感染HBV。接著，從處理后的細(xì)胞單層制備單細(xì)胞懸液，按10X Genomics協(xié)議進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序文庫(kù)制備，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度120至420核苷酸。之后，用Illumina HiSeq PE150平臺(tái)測(cè)序，平均深度約25000讀長(zhǎng)/細(xì)胞，采用成對(duì)端和單索引參數(shù)。數(shù)據(jù)分析用Seurat V3軟件包進(jìn)行。同時(shí)，通過PCR技術(shù)富集HBV讀數(shù)，線性擴(kuò)增HBV轉(zhuǎn)錄物最后120個(gè)核苷酸后進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增和重疊PCR。此外，用CRISPR-Cas9技術(shù)耗竭高豐度基因，設(shè)計(jì)sgRNA靶向三個(gè)最豐富基因，處理樣品但不破壞HBV轉(zhuǎn)錄本。最后，提取純化完整HBV序列并進(jìn)行重疊PCR。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：Huh7.5-NTCP細(xì)胞單細(xì)胞RNA測(cè)序分析：HBV感染影響

對(duì)未進(jìn)行基因組富集的Huh7.5-NTCP細(xì)胞開展單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，這些細(xì)胞分為模擬感染(作為對(duì)照組)和HBV感染兩組。

(A)圖中每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)細(xì)胞，其中紅色點(diǎn)標(biāo)識(shí)出能檢測(cè)到HBV RNA的細(xì)胞。(B)展示的是單個(gè)細(xì)胞內(nèi)HBV RNA的相對(duì)表達(dá)水平，該水平是經(jīng)自然對(duì)數(shù)Ln尺度歸一化處理的。此處的UMAP是“均勻流形近似和投影”的縮寫。

圖2：PCR基因組富集后Huh7.5-NTCP細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測(cè)序分析

對(duì)采用PCR進(jìn)行基因組富集后的Huh7.5-NTCP細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，這些細(xì)胞分為模擬感染(對(duì)照組)和HBV感染組。

(A)圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，紅色點(diǎn)表示可檢測(cè)到HBV RNA的細(xì)胞。(B)展示的是單個(gè)細(xì)胞中HBV RNA的相對(duì)表達(dá)水平，該水平是經(jīng)自然對(duì)數(shù)Ln尺度在單細(xì)胞間進(jìn)行歸一化處理的。

圖3：PCR擴(kuò)增與CRISPR技術(shù)基因組富集后Huh7.5-NTCP細(xì)胞的單細(xì)胞RNA測(cè)序分析

對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增和CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因組富集的Huh7.5-NTCP細(xì)胞開展單細(xì)胞RNA測(cè)序分析，細(xì)胞分為模擬感染(對(duì)照)和HBV感染兩組。(A)圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，紅色點(diǎn)標(biāo)識(shí)出能檢測(cè)到HBV RNA的細(xì)胞。(B)展示單個(gè)細(xì)胞內(nèi)HBV RNA的相對(duì)表達(dá)水平，該水平經(jīng)自然對(duì)數(shù)Ln尺度在單細(xì)胞間歸一化處理。右側(cè)的“小提琴”圖描繪了細(xì)胞中HBV RNA表達(dá)水平的分布情況。

圖4：Huh7.5-NTCP細(xì)胞在四種不同處理?xiàng)l件下單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的聚類分析

對(duì)Huh7.5-NTCP細(xì)胞在四種不同處理?xiàng)l件下的單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，這四種條件分別為：模擬感染、HBV感染、模擬感染加干擾素(IFN)處理、HBV感染加干擾素(IFN)處理。分析涵蓋了7370個(gè)細(xì)胞。結(jié)果顯示，基于基因表達(dá)，這些細(xì)胞被劃分為九個(gè)不同的聚類群。

研究結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，直接單細(xì)胞RNA測(cè)序分析顯示僅0.6%的HBV感染Huh7.5-NTCP細(xì)胞能檢測(cè)到HBV基因。通過PCR擴(kuò)增后，約7%的細(xì)胞可檢測(cè)到HBV基因，但同時(shí)富集了其他高豐度基因。利用CRISPR技術(shù)耗竭高豐度基因后，74%的HBV感染細(xì)胞能檢測(cè)到HBV基因表達(dá)?；蚓垲惙治鲲@示，HBV感染未顯著改變宿主細(xì)胞基因表達(dá)，而干擾素處理則顯著改變了基因表達(dá)，表明HBV是一種“隱身病毒”，既不刺激也不抑制干擾素反應(yīng)。CRISPR技術(shù)在富集HBV轉(zhuǎn)錄本中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，支持了HBV作為“隱身病毒”的結(jié)論。