在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，生物發(fā)光成像技術(shù)因其高信噪比而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞測(cè)定和動(dòng)物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類(lèi)有限，限制了同時(shí)成像多個(gè)分子和細(xì)胞事件的能力。為了突破這一限制，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了一種新型的ATP非依賴(lài)性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經(jīng)過(guò)工程改造以增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲(chóng)或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產(chǎn)生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報(bào)告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時(shí)間的變化可以用來(lái)定量腫瘤生長(zhǎng)，甚至在少量血清中也能檢測(cè)到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲(chóng)熒光素酶的結(jié)合使用，為在完整細(xì)胞和活體小鼠中定量TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開(kāi)發(fā)中擴(kuò)展了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像能力。NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)時(shí)對(duì)樣本的侵入性更小，有助于保持細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應(yīng)、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點(diǎn)，使其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報(bào)告基因，不僅增強(qiáng)了我們對(duì)生物過(guò)程的理解和疾病機(jī)理的研究，而且在開(kāi)發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標(biāo)題：Illuminating the mechanism and allosteric behavior of NanoLuc luciferase

發(fā)表期刊：Nature Communications

中文標(biāo)題：揭示NanoLuc熒光素酶的機(jī)制和變構(gòu)行為

發(fā)表期刊：《Nature Communications》

影響因子：16.6

作者單位：

1.Loschmidt Laboratories, Department of Experimental Biology and RECETOx, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Bld. 013, 625 00 Brno, Czech Republic.

2.International Clinical Research Center, St. Anne's University Hospital Brno, Pekarska 53, 656 91 Brno, Czech Republic.

3.Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Masaryk University, Kamenice 753/5, 625 00 Brno, Czech Republic.

4.Unité de Chimie et Biocatalyse, Institut Pasteur, UMR 3523, CNRS, 28 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15, Paris, France.

作者信息：Michal Nemergut, Daniel Pluskal, Jana Horackova, Tereza Sustrova, Jan Tulis.

研究背景

NanoLuc熒光素酶是一種經(jīng)過(guò)工程改造的β-桶折疊熒光素酶，雖然其開(kāi)發(fā)已有10年歷史，但其催化機(jī)制仍然令人困惑。NanoLuc是基于天然深海蝦熒光素酶(OLuc)優(yōu)化而來(lái)，通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造，使其具有更高的活性和穩(wěn)定性。它能夠催化新型底物furimazine(FMZ)氧化為furimamide(FMA)，產(chǎn)生比傳統(tǒng)熒光素酶(如螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶)更強(qiáng)的光信號(hào)，廣泛應(yīng)用于生物成像、蛋白相互作用研究和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)傳感器等領(lǐng)域。然而，盡管NanoLuc在技術(shù)和商業(yè)上取得了巨大成功，其熒光素結(jié)合位點(diǎn)和產(chǎn)生藍(lán)光的機(jī)制仍未明確。此外，F(xiàn)MZ底物存在溶解性差、細(xì)胞毒性以及成本較高等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。

研究方法

本文采用了一系列實(shí)驗(yàn)方法來(lái)研究NanoLuc熒光素酶的催化機(jī)制和變構(gòu)行為。首先，通過(guò)化學(xué)合成方法制備了熒光素(CTZ)和其類(lèi)似物(如FMZ和azaFMZ)。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)過(guò)表達(dá)并純化了NanoLuc及其突變體，并通過(guò)共晶實(shí)驗(yàn)解析了NanoLuc與不同熒光素復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。通過(guò)小角X射線散射(SAXS)技術(shù)研究了NanoLuc在溶液中的構(gòu)象變化。此外，利用熒光素酶活性測(cè)定法評(píng)估了NanoLuc及其突變體的催化活性，并通過(guò)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了其動(dòng)力學(xué)參數(shù)。為了進(jìn)一步探索NanoLuc的變構(gòu)機(jī)制，結(jié)合分子對(duì)接和自適應(yīng)采樣分子動(dòng)力學(xué)模擬(ASMD)技術(shù)，研究了熒光素在NanoLuc中的結(jié)合和解離過(guò)程。這些方法的綜合應(yīng)用揭示了NanoLuc熒光素酶的催化機(jī)制及其變構(gòu)行為的分子基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：NanoLuc熒光素酶FMA(furimamide)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特征

圖a為FMA-oxyluciferin結(jié)合位點(diǎn)的2Fo-Fc電子密度圖(等值面水平為1.2σ)。圖b為NanoLuc非對(duì)稱(chēng)二聚體的整體結(jié)構(gòu)，其中鏈A為青色，鏈B為藍(lán)色，結(jié)合的FMA熒光素為黃色。圖c為鏈A和鏈B的疊加，顯示了導(dǎo)致二聚體界面不對(duì)稱(chēng)的結(jié)構(gòu)元素(包括螺旋H4、環(huán)L7和鏈S4，以橙色標(biāo)記)。圖d為NanoLuc同二聚體的B因子表示。圖e為二聚體界面的可視化，所有參與二聚體界面的殘基以空間填充球表示，F(xiàn)MA以黃色球表示。圖f為NanoLuc二聚體中鏈A和鏈B在二級(jí)結(jié)構(gòu)水平上的相互作用圖，由Protein Contact Atlas計(jì)算和可視化。圖g為FMA結(jié)合的NanoLuc二聚體的切面表面表示。圖h為FMA結(jié)合口袋的特寫(xiě)，活性位點(diǎn)的殘基以棍狀表示，關(guān)鍵氫鍵以黃色虛線表示。圖i為NanoLuc與O. gracilirostris熒光素酶(OLuc)催化單元的序列比對(duì)，NanoLuc中的二級(jí)結(jié)構(gòu)元素顯示在比對(duì)上方，NanoLuc工程改造過(guò)程中突變的氨基酸殘基以紅點(diǎn)標(biāo)記。

圖2：NanoLuc熒光素酶與CEl(coelenteramide)結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)

圖a為CEl-oxyluciferin結(jié)合位點(diǎn)的2Fo-Fc電子密度圖(等值面水平為1.2σ)。圖b為NanoLuc同四聚體的整體結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)尾對(duì)尾的非對(duì)稱(chēng)同二聚體組成(鏈A為青色，鏈B為藍(lán)色，鏈C為紫色，鏈D為綠色)，CEl熒光素以空間填充球表示(綠色)。圖c為CEl結(jié)合的NanoLuc四聚體的切面表面表示。圖d為CEl結(jié)合口袋的特寫(xiě)，活性位點(diǎn)的殘基以棍狀表示，關(guān)鍵氫鍵以黃色虛線表示。圖e為FMA(黃色)和CEl(綠色)結(jié)合模式的疊加。

圖3：NanoLuc熒光素酶β-桶結(jié)構(gòu)在開(kāi)放和閉合狀態(tài)之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)換

圖a為卡通表示的(i)無(wú)配體的apo-NanoLuc結(jié)構(gòu)(PDB ID: 5BOU)、(iii)FMA結(jié)合的NanoLuc結(jié)構(gòu)以及(ii)兩者的疊加。H93和Y94殘基以及FMA熒光素以空間填充球表示。圖b為(i)無(wú)配體的apo-NanoLuc結(jié)構(gòu)、(iii)FMA結(jié)合的NanoLuc結(jié)構(gòu)以及(ii)兩者的疊加的熒光素結(jié)合表面口袋的特寫(xiě)。R43、H57、K89、H93和Y94殘基以空間填充球表示，F(xiàn)MA熒光素以黃色棍狀表示。圖c為氯離子結(jié)合位點(diǎn)1和2的2Fo-Fc電子密度圖(等值面水平為1.2σ)。圖d和e分別為NanoLuc β-桶內(nèi)部在閉合狀態(tài)(d)和開(kāi)放狀態(tài)(e)的切面表面表示，注意在閉合狀態(tài)的β-桶中，兩個(gè)氯離子結(jié)合在β-桶內(nèi)部。

圖4：NanoLuc突變體的特性分析圖a為NanoLuc突變體與CTZ(左列)和FMZ(右列)熒光素的相對(duì)熒光素酶活性熱圖，以NanoLuc野生型為100%。圖b為FMA結(jié)合的NanoLuc野生型非對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)構(gòu)(i)和無(wú)熒光素的NanoLuc-Y94A突變體對(duì)稱(chēng)二聚體結(jié)構(gòu)(ii)及其疊加(iii)，酪氨酸-酪氨酸門(mén)控殘基Y81和Y94(A94)以及FMA熒光素以空間填充球表示。圖c為NanoLuc熒光素酶CEl結(jié)合的熒光素結(jié)合表面位點(diǎn)的特寫(xiě)，三個(gè)突變后增加生物發(fā)光的殘基D9、H57和K89以青色空間填充球表示，其他蛋白殘基以青色棍狀表示，CEl熒光素以綠色棍狀表示。圖d為NanoLuc突變體與CTZ(左列)和FMZ(右列)熒光素的相對(duì)熒光素酶活性熱圖，以NanoLuc野生型為100%。圖e為雙突變NanoLuc-D9R/K89R和三突變NanoLuc-D9R/H57A/K89R的熒光素酶活性相對(duì)增加倍數(shù)(包括標(biāo)準(zhǔn)誤差)，以NanoLuc野生型為1。絕對(duì)的熒光素酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、kcat和kcat/Km)值總結(jié)于表1。圖f和g為長(zhǎng)期活細(xì)胞生物發(fā)光成像，展示培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞表達(dá)原始NanoLuc或工程化的NanoLuc-CEl，并分別使用EnduRen(f)或Nano-Glo Endurazine(g)底物。熒光素酶活性在加入相應(yīng)熒光素后通過(guò)LuminoCell設(shè)備測(cè)量，積分時(shí)間為5分鐘。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表三個(gè)重復(fù)的平均酶活性，標(biāo)準(zhǔn)誤差以平均曲線周?chē)年幱皡^(qū)域表示。

圖5：NanoLuc熒光素酶的催化機(jī)制

圖a展示了azaCTZ結(jié)合在NanoLuc-CEl催化位點(diǎn)的電子密度圖。圖b和c為NanoLuc的整體結(jié)構(gòu)和azaCTZ結(jié)合位點(diǎn)的特寫(xiě)，關(guān)鍵殘基和水分子以不同顏色標(biāo)記。圖d為活性位點(diǎn)突變分析，顯示突變對(duì)熒光素酶活性的影響。圖e和f通過(guò)模型化和藍(lán)圖形式展示了催化位點(diǎn)中氧氣、CTZ和CEl的結(jié)合及反應(yīng)機(jī)制，包括CTZ的去質(zhì)子化、自由基反應(yīng)、環(huán)化和發(fā)光過(guò)程。

圖6：NanoLuc復(fù)合物的分子對(duì)接和計(jì)算模擬研究

通過(guò)分子對(duì)接，研究了FMZ與NanoLuc單體二聚體的結(jié)合模式，并與晶體結(jié)構(gòu)中的FMA進(jìn)行了對(duì)比。計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)NanoLuc存在兩個(gè)潛在的通道通往熒光素結(jié)合腔，為底物進(jìn)入提供了可能路徑。動(dòng)力學(xué)模擬揭示了CTZ在NanoLuc中的結(jié)合姿態(tài)及其與周?chē)鷼埢南嗷プ饔?。此外，研究還分析了NanoLuc閉合β-桶結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵突變位點(diǎn)，這些突變有助于最大化FMZ的熒光。結(jié)合概率分析表明，F(xiàn)MZ在單體和二聚體NanoLuc表面口袋中的結(jié)合具有不同的概率分布。最后，通過(guò)力場(chǎng)分析計(jì)算了不同NanoLuc二聚體亞基分離所需的平均力，揭示了其力學(xué)特性。這些研究為理解NanoLuc的結(jié)構(gòu)與功能提供了重要依據(jù)，并為基于NanoLuc的生物傳感器設(shè)計(jì)提供了理論支持。

研究結(jié)論

本研究通過(guò)結(jié)構(gòu)分析、突變體實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬揭示了NanoLuc熒光素酶的特性。發(fā)現(xiàn)酶表面存在一個(gè)新的熒光素結(jié)合位點(diǎn)，由β-桶結(jié)構(gòu)的凹槽形成，與脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)重疊。SAXS分析確認(rèn)NanoLuc在溶液中以單體形式存在，且β-桶結(jié)構(gòu)存在開(kāi)放和閉合狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。突變體研究顯示，某些突變顯著提高了CTZ的生物發(fā)光，而不影響FMZ。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，工程化的NanoLucCTZ突變體在長(zhǎng)期活細(xì)胞成像中表現(xiàn)優(yōu)越。共結(jié)晶結(jié)構(gòu)和模擬揭示了熒光素進(jìn)入催化位點(diǎn)的路徑，且FMZ結(jié)合顯著穩(wěn)定了酶的二聚體形式。這些發(fā)現(xiàn)為理解NanoLuc的作用機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。