在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域，生物發(fā)光成像技術(shù)因其高信噪比而被廣泛應(yīng)用于細胞測定和動物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類有限，限制了同時成像多個分子和細胞事件的能力。為了突破這一限制，科學(xué)家們開發(fā)了一種新型的ATP非依賴性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經(jīng)過工程改造以增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產(chǎn)生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時間的變化可以用來定量腫瘤生長，甚至在少量血清中也能檢測到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲熒光素酶的結(jié)合使用，為在完整細胞和活體小鼠中定量TGF-β信號傳導(dǎo)的兩個關(guān)鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開發(fā)中擴展了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像能力。NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標記細胞和蛋白質(zhì)時對樣本的侵入性更小，有助于保持細胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應(yīng)、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點，使其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報告基因，不僅增強了我們對生物過程的理解和疾病機理的研究，而且在開發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標題：A Vector Nanoplatform for the Bioimaging of Deep-Seated Tumors

中文標題：一種用于深部腫瘤生物成像的載體納米平臺

發(fā)表期刊：《Acta Naturae》

影響因子：2

作者單位：

1.Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russian Academy of Science, Moscow, 117997 Russian Federation

2.Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, 119991 Russian Federation

3.National Research Centre “Kurchatov Institute”, Moscow, 123098 Russian Federation

作者信息：E. I. Shramova, S. M. Deyev, G. M. Proshkina

研究背景

盡管癌癥治療取得了巨大進展，但由于早期診斷和創(chuàng)新療法的不足，癌癥仍然是全球死亡的主要原因之一。腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散是癌癥患者死亡的主要原因，因此開發(fā)新的模型系統(tǒng)和用于臨床前研究的創(chuàng)新技術(shù)非常重要，這些技術(shù)和模型系統(tǒng)可以評估腫瘤進展過程和對治療的反應(yīng)。目前對腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)的了解推動了針對特定癌癥類型或亞型的特定分子靶點的靶向療法的開發(fā)，這些靶點包括細胞表面抗原、生長因子、受體或調(diào)節(jié)細胞周期、增殖、轉(zhuǎn)移擴散和血管生成的信號傳導(dǎo)途徑。隨著腫瘤分子分型技術(shù)的進步，臨床前腫瘤和轉(zhuǎn)移的無創(chuàng)靶向分子成像技術(shù)正在實驗?zāi)[瘤學(xué)中得到快速發(fā)展。實時全身體光生物成像基于熒光和發(fā)光系統(tǒng)，是現(xiàn)代臨床前研究的不可或缺的工具。生物發(fā)光成像依賴于通過熒光素酶氧化特定底物產(chǎn)生的可見光的檢測，而熒光成像則需要外部光源來激發(fā)熒光標記，這限制了該方法在檢測深部腫瘤中的應(yīng)用。為了克服這些限制，正在開發(fā)基于共振能量轉(zhuǎn)移機制的光學(xué)生物成像方法，如生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，這些方法在臨床前研究中越來越被采用。BRET系統(tǒng)在全身水平的檢測靈敏度更高，因此更受歡迎，因為它們?nèi)狈εc熒光團激發(fā)相關(guān)的自熒光和光漂白。

研究方法

本研究通過基因克隆和蛋白質(zhì)生產(chǎn)，將NanoLuc-LSSmKate1基因克隆到pET22b載體中，并通過自動誘導(dǎo)方法生產(chǎn)NanoLuc-LSSmKate1、NanoLuc和DARPin_9-29蛋白。通過記錄NanoLuc-LSSmKate1和NanoLuc在furimazine存在下的發(fā)光光譜，評估了BRET效率。接著，將NanoLuc-LSSmKate1包載到脂質(zhì)體中，并通過sulfo-EMCS和DARPin 9-29的功能化，制備了HER2特異性脂質(zhì)體。使用SKOV3ip1和SKOV3.ip1-NanoLuc細胞系進行實驗，通過流式細胞術(shù)和共聚焦顯微鏡評估了DARPin 9-29靶向模塊的功能活性和結(jié)合能力。最后，通過在Balb/c nu/nu小鼠中進行生物發(fā)光成像，評估了脂質(zhì)體在體內(nèi)的效果。

實驗結(jié)果

圖1：基于NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器和HER2特異性脂質(zhì)體的靶向納米平臺用于深部腫瘤的無創(chuàng)診斷

將基因編碼的NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器整合到脂質(zhì)體中，脂質(zhì)體的外表面修飾有HER2特異性DARPin 9-29模塊。在動物體內(nèi)存在熒光素酶底物的情況下，紅熒光蛋白無需外部光源即可被激活，從而實現(xiàn)在動物體內(nèi)對深部腫瘤的活體實時檢測。

圖2：NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器的特性

(A) NanoLuc熒光素酶在30 μM furimazine存在下的歸一化發(fā)光光譜(藍色曲線)和LSSmKate1熒光(深紅色曲線)。

(B) NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器的示意圖及工作原理：NanoLuc熒光素酶高度特異性地氧化其底物furimazine，其氧化形式furimamide在藍光譜區(qū)發(fā)光。部分能量非輻射性地轉(zhuǎn)移到與NanoLuc熒光素酶位于同一多肽鏈上的LSSmKate1，使LSSmKate1開始熒光。

(C) 純化NanoLuc-LSSmKate1蛋白的吸收光譜和體外蛋白樣品。

(D) 在熒光素酶底物存在下，使用IVIS Spectrum CT系統(tǒng)在無外部光激發(fā)(激發(fā)阻斷模式)條件下記錄的NanoLuc-LSSmKate1(薰衣草色曲線)和NanoLuc(藍色曲線)的熒光光譜。提供了計算NanoLuc-LSSmKate1系統(tǒng)中共振能量轉(zhuǎn)移效率的公式。

圖3：載有NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器的HER2特異性脂質(zhì)體的特性

(A) 空脂質(zhì)體(綠色曲線)和含NanoLuc-LSSmKate1的脂質(zhì)體(藍色曲線)的吸收光譜。紫色曲線對應(yīng)于包載入脂質(zhì)體中的NanoLuc-LSSmKate1蛋白。

(B) 流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1)與HER2陽性SKOV3.ip1細胞的受體特異性相互作用。藍色曲線對應(yīng)于細胞的自熒光(對照)，綠色曲線對應(yīng)于經(jīng)DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1)處理的細胞。圖中顯示了平均熒光強度(MFI)。信號在488 nm激光激發(fā)下在紅色熒光通道(PerCp-H，615±20 nm)檢測。

(C) SKOV3.ip1細胞與DARP-Lip(NanoLuc-LSSmKate1)孵育20分鐘(左圖)和90分鐘(右圖)后的合并共聚焦圖像。藍色熒光通道(λ= 405 nm，檢測410-520 nm)和紅色熒光通道(λ= 488 nm，檢測600-755 nm)的圖像合并顯示。細胞核用Hoechst 33342染色。

圖4：載有NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器的HER2特異性脂質(zhì)體在光學(xué)生物成像中的應(yīng)用

實時活體發(fā)光(上)和熒光(下)圖像在IVIS Spectrum CT系統(tǒng)上記錄。圖像在兩種不同的信號檢測模式下獲得：上圖在生物發(fā)光模式下;下圖在無熒光團激發(fā)的熒光模式下。

研究結(jié)論

本研究開發(fā)了一種系統(tǒng)，能夠?qū)崟r無創(chuàng)檢測HER2陽性的腹膜播散性腫瘤，利用載有NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器的靶向脂質(zhì)體。該系統(tǒng)具有高BRET傳感器包載效率(圖3)和體外及體內(nèi)對HER2受體的特異性(圖3和圖4)，能夠進行全身無創(chuàng)腫瘤過程成像(圖4)。我們認為，基于NanoLuc-LSSmKate1 BRET傳感器的實時光學(xué)生物成像靶向系統(tǒng)，可以成為優(yōu)化新型靶向藥物臨床前研究的高效平臺。此外，通過簡單改變脂質(zhì)體表面的載體分子，開發(fā)的靶向BRET傳感器原理可以成為非侵入性成像任何分子特征深部腫瘤的通用平臺。