基本信息

英文標(biāo)題：Circ_ZNF512-mediated miR-181d-5p inhibition limits cardiomyocyte autophagy and promotes myocardial ischemia/reperfusion injury through an EGR1/mTORC1 pathway

中文標(biāo)題：抑制circ_znf512介導(dǎo)的miR-181d-5p通過EGR1/mTORC1通路限制心肌細(xì)胞自噬，促進(jìn)心肌缺血/再灌注損傷

發(fā)表期刊：《Journal of Medicinal Chemistry》

影響因子：7.3

作者單位：鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室

作者信息：Chen Huang，Liliang Shu，Hualu Zhang，Xiaohua Zhu，Gongcheng Huang，Jing Xu.

研究背景

● 心肌缺血/再灌注(I/R)損傷是全球最致命的心血管疾病之一。

● Circular RNAs (circRNAs) 是內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本，在多種生物、發(fā)育階段和病理條件下表達(dá)。

● circRNAs 被證實參與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，包括I/R損傷和心肌梗死。

● circRNAs 在這些疾病中被視為潛在的治療靶點。

研究方法

● 微陣列基因表達(dá)譜 從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索到與心肌I/R損傷相關(guān)的mRNA數(shù)據(jù)集GSE4105和miRNA數(shù)據(jù)集GSE50885。構(gòu)建了小鼠心肌I/R損傷模型，并對心肌組織進(jìn)行了circRNA測序。

● 小鼠心肌I/R損傷模型的建立 使用了104只雄性C57BL/6小鼠，其中88只用于構(gòu)建心肌I/R損傷模型，76只建模成功，其余16只進(jìn)行了假手術(shù)。

● 心肌組織circRNA測序 建立了兩個小鼠心肌I/R損傷模型用于測序，并使用兩個正常心臟樣本作為對照。

● 心臟功能指數(shù)測定 建模后7天，通過超聲檢測小鼠的心臟功能指數(shù)。

● Evans Blue/TTC雙重染色 通過Evans Blue/TTC雙重染色來確定心肌缺血和梗死的面積。

● HE染色 對石蠟包埋的心肌組織進(jìn)行HE染色，以觀察組織結(jié)構(gòu)。

● 透射電鏡(TEM) 使用透射電鏡觀察小鼠心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

● H/R細(xì)胞模型的開發(fā)和細(xì)胞處理 從1-2天大的C57BL/6小鼠中分離出心肌細(xì)胞，并在缺氧/復(fù)氧條件下處理。

● 免疫熒光檢測 通過免疫熒光檢測LC3熒光斑點的數(shù)量和分布。

● Hoechst 33258染色 使用Hoechst 33258染色來觀察細(xì)胞核形態(tài)。

● 雙熒光素酶報告基因檢測 通過雙熒光素酶報告基因檢測來驗證circ_ZNF512和miR-181d-5p之間的結(jié)合。

● 細(xì)胞質(zhì)/核分離試驗 使用PARIS試劑盒分離細(xì)胞質(zhì)和核成分。

● RIP實驗 使用RIP試劑盒來分析circ_ZNF512/miR-181d-5p和Ago2的結(jié)合。

● RNA下拉實驗 通過RNA下拉實驗來檢測circ_ZNF512的富集。

● RNA分離和定量 從心肌組織和細(xì)胞中分離并定量總RNA。

● Western Blot分析 通過Western Blot分析來檢測蛋白表達(dá)。

實驗結(jié)果

圖1： I/R小鼠心肌組織和H/R誘導(dǎo)細(xì)胞中EGR1表達(dá)的升高

(A) GSE4105數(shù)據(jù)集中與心肌I/R損傷相關(guān)的差異表達(dá)mRNA火山圖。黑色點表示沒有顯著差異的基因，紅色點表示顯著上調(diào)的基因，綠色點表示顯著下調(diào)的基因。

(B) GSE4105數(shù)據(jù)集中前50個基因的熱圖。

(C) GSE4105數(shù)據(jù)集中EGR1表達(dá)數(shù)據(jù)的箱型圖。左側(cè)的藍(lán)色箱表示對照組樣本的表達(dá)，右側(cè)的紅色箱表示心肌I/R損傷樣本的表達(dá)。

(D) 通過超聲心動圖檢測的心臟功能相關(guān)指標(biāo)(LVESD和LVEDD)。

(E) I/R小鼠心肌組織的Evans Blue/TTC雙重染色。

(F) 通過RT-qPCR和Western Blot分析I/R小鼠心肌組織中EGR1的mRNA和蛋白表達(dá)。

(G) 通過RT-qPCR和Western Blot分析確定的H/R誘導(dǎo)細(xì)胞中EGR1的mRNA和蛋白表達(dá)。*與假手術(shù)小鼠或?qū)φ战M細(xì)胞相比，p < 0.05。每組小鼠n=8。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖2：敲除EGR1增強體外心肌細(xì)胞自噬并阻礙凋亡

(A) 通過RT-qPCR在心肌細(xì)胞中驗證sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(B) 通過Western Blot分析在心肌細(xì)胞中驗證sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(C) 通過免疫熒光GFP-LC3實驗檢測轉(zhuǎn)染sh-EGR1的心肌細(xì)胞中自噬體的形成。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的細(xì)胞核為藍(lán)色，GFP-LC3信號為綠色。

(D) 通過Western Blot分析在轉(zhuǎn)染sh-EGR1的心肌細(xì)胞中檢測LC3II/LC3I和p62的蛋白表達(dá)。

(E) 通過RT-qPCR分析在轉(zhuǎn)染sh-EGR1的心肌細(xì)胞中檢測LC3II/LC3I和p62的mRNA表達(dá)。

(F) 通過Hoechst 33258染色評估轉(zhuǎn)染sh-EGR1的心肌細(xì)胞的凋亡情況。

(G) 通過Western Blot分析在心肌細(xì)胞中檢測與凋亡相關(guān)的基因(Cas3、Cas9、Bax和Bcl-2)的蛋白表達(dá)。

(H) 通過RT-qPCR分析在心肌細(xì)胞中檢測與凋亡相關(guān)的基因(Cas3、Cas9、Bax和Bcl-2)的mRNA表達(dá)。*與轉(zhuǎn)染sh-NC的心肌細(xì)胞相比，p < 0.05。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖3：敲除EGR1增強I/R小鼠心肌細(xì)胞的自噬，從而延遲心肌損傷

(A) 通過RT-qPCR在小鼠心肌組織中驗證sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(B) 通過Western Blot分析在小鼠心肌組織中驗證sh-EGR1-1、sh-EGR1-2和sh-EGR1-3序列的沉默效率。

(C) 通過超聲心動圖檢測在sh-EGR1處理的I/R小鼠中心臟功能的相關(guān)指標(biāo)。

(D) 通過Evans Blue/TTC雙重染色觀察sh-EGR1處理的I/R小鼠心肌組織的梗死面積。

(E) 通過HE染色觀察sh-EGR1處理的I/R小鼠心肌組織的病理變化。

(F) 通過透射電鏡(TEM，20 000×)觀察sh-EGR1處理的I/R小鼠心肌組織中線粒體的肌絲結(jié)構(gòu)。

(G) 通過Western Blot分析檢測sh-EGR1處理的I/R小鼠心肌組織中LC3II/LC3I和p62的蛋白表達(dá)。*與假手術(shù)小鼠或sh-NC處理的相比，p < 0.05。每組小鼠n=8。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖4：EGR1是心肌細(xì)胞中miR-181d-5p的靶基因

(A) GSE50885數(shù)據(jù)集中與心肌I/R損傷相關(guān)的差異表達(dá)miRNA火山圖。黑色點表示沒有顯著差異的miRNA，紅色點表示顯著上調(diào)的miRNA，綠色點表示顯著下調(diào)的miRNA。

(B) GSE50885數(shù)據(jù)集中前50個miRNA的熱圖。

(C) 通過TargetScan和starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的EGR1的上游miRNA與GSE50885數(shù)據(jù)集中下調(diào)的miRNA的韋恩圖分析。

(D) GSE50885數(shù)據(jù)集中miR-181d-5p表達(dá)數(shù)據(jù)的箱型圖。左側(cè)的藍(lán)色箱表示對照組樣本的表達(dá)，右側(cè)的紅色箱表示心肌I/R損傷樣本的表達(dá)。

(E) starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測的人類和小鼠中miR-181d-5p與EGR1的結(jié)合位點。

(F) 在293T細(xì)胞中通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證miR-181d-5p與EGR1的結(jié)合。

(G) 通過RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染miR-181d-5p模擬物或抑制劑的心肌細(xì)胞中EGR1的表達(dá)。

(H) 通過Western Blot檢測轉(zhuǎn)染miR-181d-5p模擬物或抑制劑的心肌細(xì)胞中EGR1的蛋白表達(dá)。

(I) I/R小鼠心肌組織和H/R誘導(dǎo)細(xì)胞中miR-181d-5p的表達(dá)。*與轉(zhuǎn)染 mimic-NC 的293T細(xì)胞、轉(zhuǎn)染 mimic-NC 或 inhibitor-NC 的心肌細(xì)胞、假手術(shù)小鼠或?qū)φ战M細(xì)胞相比，p < 0.05。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖5：miR-181d-5p通過靶向EGR1在體外和體內(nèi)促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬并改善心肌損傷

(A) 通過免疫熒光GFP-LC3實驗檢測轉(zhuǎn)染oe-EGR1或與miR-181d-5p模擬物聯(lián)合處理的心肌細(xì)胞中自噬體的形成。

(B) 通過Western Blot分析檢測轉(zhuǎn)染oe-EGR1或與miR-181d-5p模擬物聯(lián)合處理的心肌細(xì)胞中LC3II/LC3I和p62的蛋白表達(dá)。

(C) 通過Hoechst 33258染色評估轉(zhuǎn)染oe-EGR1或與miR-181d-5p模擬物聯(lián)合處理的心肌細(xì)胞的凋亡情況。

(D) 通過Evans Blue/TTC雙重染色觀察I/R小鼠心肌組織在處理oe-EGR1或與miR-181d-5p agomiR聯(lián)合處理后的梗死面積。

(E) 通過HE染色觀察I/R小鼠心肌組織在處理oe-EGR1或與miR-181d-5p agomiR聯(lián)合處理后的病理變化。

(F) 通過Western Blot分析檢測I/R小鼠心肌組織在處理oe-EGR1或與miR-181d-5p agomiR聯(lián)合處理后的LC3II/LC3I和p62的蛋白表達(dá)。*與轉(zhuǎn)染mimic-NC + oe-NC或mimic-NC + oe-EGR1的小鼠心肌細(xì)胞相比，或與處理agomiR-NC + oe-NC或agomiR-NC + oe-EGR1的I/R小鼠相比，p < 0.05。每組小鼠n=8。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖6：circ_ZNF512與miR-181d-5p競爭性結(jié)合并上調(diào)EGR1的表達(dá)

(A) 序列數(shù)據(jù)集中與心肌I/R損傷相關(guān)的差異表達(dá)circRNA火山圖。黑色點表示沒有顯著差異的circRNA，紅色點表示顯著上調(diào)的circRNA，綠色點表示顯著下調(diào)的circRNA。

(B) 序列數(shù)據(jù)集中前50個circRNA的熱圖。

(C) 序列數(shù)據(jù)集中mmu_circ_0012534表達(dá)數(shù)據(jù)的箱型圖。左側(cè)的藍(lán)色箱表示對照組樣本的表達(dá)，右側(cè)的紅色箱表示心肌I/R損傷樣本的表達(dá)。

(D) RNA22數(shù)據(jù)庫預(yù)測的circ_ZNF512與miR-181d-5p在人類和小鼠中的結(jié)合位點。

(E) 通過瓊脂糖凝膠電泳檢測circ_ZNF512在cDNA和gDNA中的擴(kuò)增。

(F) 通過細(xì)胞質(zhì)/核分離試驗分析circ_ZNF512的亞細(xì)胞定位。GAPDH作為細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記，U6作為核標(biāo)記。

(G) 通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證circ_ZNF512與miR-181d-5p的結(jié)合。

(H) 通過RIP實驗評估circ_ZNF512與miR-181d-5p的結(jié)合。

(I) 通過RNA下拉實驗評估circ_ZNF512與miR-181d-5p的結(jié)合。

(J) 通過RT-qPCR檢測I/R小鼠心肌組織和H/R誘導(dǎo)細(xì)胞中circ_ZNF512的表達(dá)。

(K) 通過RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染sh-circ_ZNF512的細(xì)胞中miR-181d-5p和EGR1的表達(dá)。*與假手術(shù)小鼠、對照組細(xì)胞或轉(zhuǎn)染sh-NC的細(xì)胞或處理Bio-probe NC或IgG的細(xì)胞相比，p < 0.05。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖7：circ_ZNF512與miR-181d-5p競爭性結(jié)合并上調(diào)EGR1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬并減輕心肌損傷

(A) 通過免疫熒光GFP-LC3實驗檢測轉(zhuǎn)染sh-circ_ZNF512或與miR-181d-5p抑制劑聯(lián)合處理的心肌細(xì)胞中自噬體的形成。

(B) 通過Western Blot分析檢測轉(zhuǎn)染sh-circ_ZNF512或與miR-181d-5p抑制劑聯(lián)合處理的心肌細(xì)胞中LC3II/LC3I和p62的蛋白表達(dá)。

(C) 通過Hoechst 33258染色評估轉(zhuǎn)染sh-circ_ZNF512或與miR-181d-5p抑制劑聯(lián)合處理的心肌細(xì)胞的凋亡情況。

(D) 通過Evans Blue/TTC雙重染色觀察I/R小鼠心肌組織在處理sh-circ_ZNF512或與miR-181d-5p antagomiR聯(lián)合處理后的梗死面積。

(E) 通過HE染色觀察I/R小鼠心肌組織在處理sh-circ_ZNF512或與miR-181d-5p antagomiR聯(lián)合處理后的病理變化。

(F) 通過Western Blot分析檢測I/R小鼠心肌組織在處理sh-circ_ZNF512或與miR-181d-5p antagomiR聯(lián)合處理后的LC3II/LC3I和p62的蛋白表達(dá)。*與轉(zhuǎn)染sh-NC + inhibitor-NC或sh-circ_ZNF512 + inhibitor-NC的細(xì)胞相比，或與處理sh-NC + antagomiR-NC或sh-circ_ZNF512 + antagomiR-NC的I/R小鼠相比，p < 0.05。每組小鼠n=8。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖8：circ_ZNF512/miR-181d-5p/EGR1交互作用激活心肌細(xì)胞中的mTORC1/TFEB信號通路

(A) 通過Western Blot分析確定I/R小鼠心肌組織中mTORC1和TFEB的表達(dá)。

(B) 通過Western Blot分析確定H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中mTORC1和TFEB的表達(dá)。

(C) 通過Western Blot分析確定H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞在處理sh-circ_ZNF512后的mTORC1和TFEB的表達(dá)。

(D) 通過Western Blot分析確定H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞在處理sh-circ_ZNF512、sh-circ_ZNF512 + miR-181d-5p抑制劑、miR-181d-5p模擬物或miR-181d-5p模擬物 + oe-EGR1后的EGR1、mTORC1和TFEB的表達(dá)。*與假手術(shù)小鼠、對照組細(xì)胞、轉(zhuǎn)染sh-NC的細(xì)胞、sh-circ_ZNF512 +抑制劑-NC或miR-181d-5p模擬物 + oe-NC的細(xì)胞相比，p < 0.05。

實驗獨立進(jìn)行了三次。

圖9. 心肌I/R損傷中circ_ZNF512沉默保護(hù)作用的分子機(jī)制

circ_ZNF512的沉默減弱了其與miR-181d-5p的競爭性結(jié)合，從而下調(diào)了miR-181d-5p靶基因EGR1的表達(dá)。

circ_ZNF512的沉默激活了mTORC1/TFEB信號通路，從而促進(jìn)了心肌細(xì)胞自噬。

通過促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，circ_ZNF512的沉默預(yù)防了心肌I/R損傷。

研究結(jié)論

● 當(dāng)前研究表明，circ_ZNF512的沉默能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬并保護(hù)心臟免受I/R損傷。

● 這種保護(hù)作用可能與miR-181d-5p的上調(diào)、EGR1基因的下調(diào)以及mTORC1/TFEB信號通路的激活有關(guān)。

● circ_ZNF512/miR-181d-5p/EGR1/mTORC1/TFEB軸可能是心肌I/R損傷的未來治療策略。

● 需要進(jìn)一步研究mTORC1/TFEB信號通路在心肌細(xì)胞自噬和心肌I/R損傷中的作用，以驗證研究的發(fā)現(xiàn)。