基本信息

英文標題：Cuproptosis-related MiR-21-5p/FDX1 axis in clear cell renal cell carcinoma and its potential impact on tumor microenvironment

中文標題：腎透明細胞癌中銅中毒相關MiR-21-5p/FDX1軸及其對腫瘤微環(huán)境的潛在影響

發(fā)表期刊：《Cells》

影響因子：6

作者單位：西南醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系、西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科等

作者信息：Mingyue Xie ，Bo Cheng ，Shuang Yu ，et al.

研究背景

細胞死亡的分子調控

細胞死亡在人體內受到精確的分子調控，包括凋亡、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡等已知方式。

最近發(fā)現一種新型細胞死亡方式——銅死亡(cuproptosis)，由銅離子載體介導，且無法被現有細胞死亡抑制劑阻斷。

銅死亡的機制

銅死亡與銅離子濃度和蛋白質脂?；芮邢嚓P。

過量銅離子結合脂?；鞍?，導致蛋白聚集、鐵硫簇蛋白丟失，引發(fā)蛋白毒性應激和細胞死亡。

已鑒定出10個與銅死亡相關的基因，其中7個促進銅死亡，3個抑制銅死亡。

FDX1的核心作用

FDX1是銅死亡的主要調控因子，通過將Cu2+還原為有毒的Cu1+，并調控蛋白質脂酰化，促進銅死亡。

FDX1在多種癌癥(如膀胱癌、肝癌、黑色素瘤和乳腺癌)中具有預后指示作用。

透明細胞腎細胞癌(ccRCC)的背景

ccRCC占腎癌的80%，主要由VHL基因失活引起。

VHL失活導致HIF-1α和HIF-2α積累，促進腫瘤生長、轉移和新血管生成。

盡管已有靶向藥物(如舒尼替尼和帕唑帕尼)，但細胞死亡抗性限制了療效。

研究目的與發(fā)現

研究探討銅死亡調控因子的臨床價值及FDX1在ccRCC中的作用。

對銅死亡敏感的患者生存期更長，可能與CD4+ T細胞浸潤有關。

FDX1抑制ccRCC細胞生長和侵襲，其表達與T分期、腫瘤分級和CD4+ T細胞浸潤相關。

FDX1受到miR-21-5p的轉錄后調控，miR-21-5p通過直接結合降低FDX1表達。

miR-21-5p/FDX1軸與ccRCC微環(huán)境中的免疫細胞浸潤密切相關。

結論與意義

miR-21-5p/FDX1軸介導的銅死亡抗性及其調控的腫瘤微環(huán)境是ccRCC進展的潛在機制。

恢復銅死亡可能成為治療ccRCC的替代策略。

研究方法

數據收集

從癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達綜合數據庫(GEO)下載RNA測序數據集及相關臨床信息。

從UCSC Xena獲取DNA甲基化數據集(KIRC，Illumina Human 450)。

生物信息學分析

使用“survival” R包評估TCGA-KIRC中ccRCC患者的總生存期。

使用“tinyarray” R包將TCGA樣本分為“腫瘤”組和“正?！苯M。

使用“ConsensusClusterPlus” R包將TCGA KIRC樣本分為兩個聚類，并通過主成分分析(PCA)和t-SNE分析進行可視化。

通過多變量Cox回歸分析生成銅死亡風險評分，并根據最優(yōu)截斷點將患者分為高評分組和低評分組。

使用GO和KEGG進行功能富集分析，并通過GSEA軟件進行基因集富集分析。

使用“minfi”包對DNA甲基化數據進行標準化，并可視化銅死亡調控因子的啟動子區(qū)域甲基化水平。

使用CIBERSORT算法和LM22特征矩陣評估免疫細胞浸潤水平。

細胞培養(yǎng)

使用VHL缺失型(OSRC-2)和VHL野生型(ACHN)腎癌細胞系，在10% FBS DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

siRNA轉染

使用lipofectamine 3000轉染試劑將針對FDX1的siRNA轉染至細胞中，siRNA序列由通用生物公司提供。

蛋白質印跡(Western Blotting)

使用RIPA緩沖液裂解細胞，通過SDS-PAGE分離蛋白質并轉移到尼龍膜上，使用FDX1抗體進行檢測。

實時定量PCR(RT-qPCR)

使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過逆轉錄和SYBR Green染料進行實時定量PCR檢測FDX1表達。

CCK8實驗

將RCC細胞接種于96孔板中，使用CCK8試劑盒檢測細胞活力。

Transwell侵襲實驗

使用Matrigel包被Transwell上室，將RCC細胞接種于上室中，16小時后固定并染色，計算侵襲細胞數量。

銅離子檢測

使用銅比色法檢測OSRC-2細胞中的Cu2+水平，基于580 nm吸光度值繪制標準曲線。

免疫組織化學染色(IHC)

對ccRCC組織切片進行脫蠟、抗原修復和封閉處理，使用FDX1和CD4抗體進行染色，并通過DAB顯色檢測信號。

實驗結果

圖A展示了ccRCC與正常腎組織中銅死亡調控因子的表達水平差異。

圖B比較了ccRCC與正常腎組織中銅死亡調控因子啟動子區(qū)域的甲基化水平。

圖C顯示，FDX1高表達的ccRCC患者生存期更長(Kaplan-Meier生存分析)。

圖D至圖I分別展示了DLAT、DLD、PDHB、LIAS、LIPT1和PDHA1高表達的ccRCC患者生存期顯著延長(Kaplan-Meier生存分析)。

圖中標注了顯著性水平：* p < 0.05，*** p < 0.001，**** p < 0.0001;n.s.表示無顯著性差異。

圖A展示了類別數k的累積分布函數(CDF)和delta區(qū)域分析結果。

圖B顯示了當k=2時的共識矩陣。

圖C通過主成分分析(PCA)對銅死亡敏感組(CSS)和銅死亡抵抗組(CRS)進行了分析。

圖D展示了CSS和CRS中銅死亡調控因子的表達熱圖。

圖E比較了CSS和CRS患者的臨床病理特征。

圖F顯示，CSS患者的生存期顯著長于CRS患者。

圖G展示了CSS患者中免疫細胞的估計比例。

圖H展示了CRS患者中免疫細胞的估計比例。

圖I比較了CSS和CRS患者之間的免疫細胞浸潤情況。

圖中標注了顯著性水平：* p < 0.05，*** p < 0.001，**** p < 0.0001;n.s.表示無顯著性差異。

圖A展示了七個銅死亡調控因子的多變量Cox回歸分析結果。

圖B顯示，銅死亡評分高的患者生存期顯著長于銅死亡評分低的患者。

圖C在另一個獨立數據集中驗證了銅死亡風險評分的適用性。

圖D通過AUC分析評估了圖C的結果。

圖E展示了CD4+ T記憶靜息細胞數量與銅死亡風險評分之間的相關性。

圖F展示了調節(jié)性T細胞(Treg)數量與銅死亡風險評分之間的相關性。

圖A通過Western blotting檢測了10對ccRCC樣本中FDX1的表達水平。

圖B展示了ccRCC組織微陣列中FDX1的免疫組織化學(IHC)染色結果(27/62例ccRCC樣本及其配對癌旁組織)。左圖為IHC染色的代表性圖像，右圖為IHC染色的統(tǒng)計分析。比例尺：左圖200 μm，右圖100 μm。

圖C和圖D分別通過qPCR(C)和Western blotting(D)驗證了OSRC-2細胞中FDX1的敲低效率。

圖E顯示，敲低FDX1顯著促進了OSRC-2和ACHN細胞的生長。

圖F顯示，敲低FDX1顯著增強了OSRC-2和ACHN細胞的侵襲能力。左圖為侵襲細胞的代表性圖像，右圖為侵襲細胞的統(tǒng)計分析。比例尺：100 μm。

圖G顯示，GSEA分析表明JAK-STAT信號通路在FDX1低表達的ccRCC患者中富集(上圖);FDX1 siRNA激活了OSRC-2細胞中的STAT3信號通路(下圖)。GAPDH作為內參對照。

圖中標注了顯著性水平：* p < 0.05，** p < 0.01，**** p < 0.0001。

圖A展示了不同組織學T分期的ccRCC樣本中FDX1的IHC染色代表性圖像。比例尺：上圖200 μm，下圖100 μm。

圖B展示了不同分級的ccRCC樣本中FDX1的IHC染色代表性圖像。比例尺：上圖200 μm，下圖100 μm。

圖C顯示，組織學T分期

圖D顯示，FDX1 IHC評分與ccRCC中CD4+ T細胞浸潤呈正相關(r = 0.2662，p = 0.03，n = 62)。

圖E展示了FDX1表達強度與CD4+ T細胞浸潤相關性的代表性圖像。比例尺：上圖200 μm，下圖100 μm。

圖F通過TIMER 2.0對TCGA-KIRC數據集的免疫細胞浸潤分析顯示，FDX1表達與CD4+和CD8+ T細胞數量呈正相關。

圖A展示了正常腎組織與ccRCC之間差異表達的miRNA熱圖。

圖B通過基于預后的LASSO分析篩選了差異miRNA。

圖C列出了14個與預后高度相關的miRNA。

圖D通過維恩圖展示了14個miRNA與FDX1靶向miRNA的交集。

圖E顯示，miR-21-5p高表達與ccRCC患者較短的總生存期相關。

圖F展示了FDX1的3'-UTR與miR-21-5p的預測結合位點(上圖)，以及miR-21-5p抑制劑處理顯著提高了ACHN和OSRC-2細胞中FDX1的表達(下圖)。GAPDH作為內參對照。

圖G通過熒光素酶報告實驗顯示，miR-21-5p模擬物顯著抑制了FDX1 3'-UTR的活性。

圖H顯示，miR-21-5p抑制劑抑制ACHN和OSRC-2細胞生長的作用可被FDX1敲低所逆轉。

圖I顯示，miR-21-5p抑制劑抑制OSRC-2細胞侵襲的作用可被FDX1敲低所阻斷。左圖為侵襲細胞的代表性圖像，右圖為統(tǒng)計分析。比例尺：100 μm。

圖J展示了miR-21-5p抑制劑或siFDX1處理前后OSRC-2細胞中Cu2+水平的變化。

圖K顯示，TCGA-KIRC數據集中miR-21-5p表達與FDX1呈負相關。

圖A展示了miR-21-5p低表達的ccRCC患者中腫瘤微環(huán)境成分的估計比例。

圖B展示了miR-21-5p高表達的ccRCC患者中腫瘤微環(huán)境成分的估計比例。

圖C比較了miR-21-5p高表達與低表達ccRCC患者之間腫瘤微環(huán)境成分的差異。

圖D展示了miR-21-5p/FDX1軸與免疫檢查點之間的相關性。

研究結論

● 銅死亡與ccRCC：銅死亡特征及其相關腫瘤微環(huán)境的預后價值已被認識，FDX1在ccRCC中具有腫瘤抑制作用。銅死亡抵抗患者生存率較低，臨床病理特征較差。

● miR-21-5p/FDX1軸：研究發(fā)現miR-21-5p調控FDX1表達，miR-21-5p/FDX1軸與ccRCC微環(huán)境中的免疫細胞浸潤(尤其是CD4+ T細胞)密切相關，FDX1具有銅死亡依賴性和獨立性的腫瘤抑制功能。

● 癌細胞抗死亡機制：癌細胞通過高表達Bcl-2等機制抵抗凋亡，某些腫瘤細胞低表達焦亡相關基因(如DFNA5和GSDME)，使其對焦亡誘導的細胞死亡不敏感。

● FDX1的調控與治療潛力：ccRCC腫瘤中FDX1表達顯著降低，miR-21-5p抑制劑可能具有治療價值。此外，表觀遺傳調控(如DNA甲基化)和其他機制(如RNA修飾)可能影響銅死亡調控因子的表達。

FDX1的銅死亡獨立性功能：敲低FDX1增加ccRCC細胞的侵襲性，并激活STAT3信號通路，表明FDX1可能通過非銅死亡途徑影響腫瘤進展。

總結與治療前景：研究揭示了miR-21-5p/FDX1軸在ccRCC中的作用，針對該軸的干預可能成為ccRCC治療的新策略。