同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(xué)(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對免疫檢查點抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問題，研究人員通過將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達到同源異體腫瘤細胞中，開發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細胞系更慢的腫瘤生長速度，這可能是由于免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達的模型對ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們在增強T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過過繼T細胞轉(zhuǎn)移實驗，研究人員驗證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細胞不僅增強了對ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標題：A Potent Micron Neoantigen Tumor Vaccine GP-Neoantigen Induces Robust Antitumor Activity in Multiple Tumor Models

中文標題：新型GP-新抗原腫瘤疫苗在多種腫瘤模型中表現(xiàn)出強大抗腫瘤效果

發(fā)表期刊：《Advanced Science》

影響因子：14.3

作者單位：

1. State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Tianjin Key Laboratory of Protein Sciences, College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, P. R. China

2. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Weihui, Henan Province 453100, P. R. China

3.Key Laboratory of Liver Disease of Guangdong Province, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

作者信息：Zhe Jing, Shuging Wang, Keyuan Xu, Qian Tang, Wenjing Li, Wei Zheng, Haobo Shi, Kailing Su, Yanting Liu, Zhangyong Hong

研究背景

腫瘤特異性新抗原由腫瘤基因的非同義突變產(chǎn)生，是誘導(dǎo)免疫排斥的理想抗原，可引發(fā)強免疫反應(yīng)且避免自身免疫風險?；谛驴乖膫€性化腫瘤疫苗是癌癥免疫治療的重要方向，但如何高效誘導(dǎo)高質(zhì)量的新抗原特異性T細胞免疫反應(yīng)仍是關(guān)鍵挑戰(zhàn)。目前主要策略包括新抗原長肽結(jié)合PolyI:C佐劑或mRNA疫苗技術(shù)，但效率有限。顆粒疫苗系統(tǒng)雖在動物模型中表現(xiàn)出色，但存在顆粒大小、形狀不均勻及批次間不一致問題，影響活性評估和臨床應(yīng)用。

研究方法

本研究提出了一種基于酵母β-1,3-葡聚糖顆粒(GPs)的新抗原疫苗系統(tǒng)。以O(shè)VA257-264為模型抗原，通過化學(xué)偶聯(lián)制備GP-OVA257-264疫苗顆粒，并驗證了其在體內(nèi)外的免疫激活能力，包括抗原呈遞細胞(APCs)的攝取、CD8+ T細胞的激活和特異性殺傷能力。此外，通過小鼠腫瘤模型評估了其抗腫瘤效果，并探索了與免疫佐劑(如PolyI:C和CpG ODN)聯(lián)合應(yīng)用的潛力。研究還擴展到多種腫瘤模型，驗證了該系統(tǒng)在不同腫瘤新抗原肽段偶聯(lián)下的免疫激活和抗腫瘤效果。

實驗結(jié)果

圖1：GP-Neoantigen抗原負載系統(tǒng)的表征

展示了基于酵母β-1,3-葡聚糖顆粒(GPs)的GP-Neoantigen疫苗系統(tǒng)的構(gòu)建和表征。

圖A展示了該疫苗激活抗腫瘤免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)腫瘤凋亡的機制示意圖。圖B描述了GP-Neoantigen抗原負載系統(tǒng)的制備過程。圖C和D通過高效液相色譜(HPLC)監(jiān)測了半胱氨酸-OVA257-264與DBCO-PEG4-馬來酰亞胺的反應(yīng)效率，以及DBCO-OVA257-264與GP-N的偶聯(lián)效率。圖E通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡展示了GP、GP-N和GP-OVA257-264的形態(tài)。圖F和G通過動態(tài)光散射分析了這些顆粒在制備后及37°C儲存不同時間的粒徑變化。圖H通過共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)圖像驗證了RhoB標記的OVA257-264肽成功偶聯(lián)到GP表面。

圖2：GP-OVA257-264顆粒被抗原呈遞細胞(APCs)攝取引發(fā)的激活和交叉呈遞圖A為CLSM圖像，顯示BMDCs與GP-OVA257-264-RhoB共培養(yǎng)24小時后的攝取情況。圖B展示了顆粒在BMDCs中定位于溶酶體的情況。圖C-E為活體成像，展示BALB/c小鼠注射GP-OVA257-264-Cy5后的熒光圖像，包括注射部位和引流淋巴結(jié)的熒光強度比較。圖F-H為FACS分析，評估C57BL/6小鼠注射FITC標記的OVA257-264、GP或GP-OVA257-264-FITC后，引流淋巴結(jié)中樹突狀細胞、巨噬細胞和B細胞的攝取比例。圖I-L展示了GP-OVA257-264對BMDCs的激活效果及其交叉呈遞效率，數(shù)據(jù)通過ANOVA和Tukey法計算顯著性。

圖3：GP-OVA顆粒誘導(dǎo)的細胞和體液免疫反應(yīng)

圖A-B為體外實驗，OT-1 TCR轉(zhuǎn)基因CD8+ T細胞在GP-OVA257-264刺激下的增殖情況，通過FACS分析顯示增殖率。

圖C-D為體內(nèi)實驗，OT-1 TCR轉(zhuǎn)基因CD8+ T細胞在GP-OVA257-264刺激下的增殖情況。

圖E-H展示了OVA257-264特異性CD8+ T細胞的增殖和激活，通過FACS分析其頻率、幼稚型和中央記憶型CD8+ T細胞的比例。

圖I為IFN-γ特異性CD8+ T細胞增殖的ELISPOT分析。圖J-L為OVA特異性CD8+ T細胞在體內(nèi)的細胞毒性實驗，展示實驗設(shè)計、熒光圖像及細胞溶解比例。圖M-O為ELISA分析OVA特異性抗體滴度，動態(tài)監(jiān)測IgG、IgG1和IgG2a的水平。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，統(tǒng)計顯著性通過單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較法計算。

圖4：GP-OVA257-264聯(lián)合TLR激動劑在EG7.OVA腫瘤模型中的抗腫瘤活性

圖A-C為預(yù)防性模型，小鼠在第3次免疫后7天接受EG7.OVA淋巴瘤細胞挑戰(zhàn)，結(jié)果顯示GP-OVA257-264顯著抑制腫瘤生長且無明顯體重變化。圖D-F為治療性模型，小鼠在接種腫瘤細胞后第5、8、12天接受疫苗免疫，結(jié)果顯示GP-OVA257-264顯著抑制腫瘤生長且體重穩(wěn)定。圖G-H和I-J展示了GP-OVA257-264與PolyI:C或CpG 2395聯(lián)合應(yīng)用在預(yù)防性和治療性模型中的抗腫瘤效果，聯(lián)合免疫顯著增強腫瘤抑制效果并提高生存率。圖K-M為單只小鼠的腫瘤生長曲線，進一步驗證聯(lián)合治療的效果。圖N-O為活體成像，顯示GP-OVA257-264與PolyI:C聯(lián)合應(yīng)用后在引流淋巴結(jié)中的分布和遷移情況。圖L為FACS分析的OVA特異性CD8+ T細胞的細胞毒性實驗結(jié)果。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，統(tǒng)計顯著性通過單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較法計算。

圖5：GP-M30在B16F10黑色素瘤模型中誘導(dǎo)的M30特異性細胞免疫反應(yīng)和抗腫瘤活性

圖A-C為ELISPOT和ELISA分析，顯示M30特異性CD8+ T細胞的IFN-γ分泌情況。C57BL/6小鼠接受M30或GP-M30聯(lián)合PolyI:C或CpG 2395免疫兩次后，脾細胞分別用M30或B16F10細胞(A)以及M30或OVA257-264(B和C)再刺激，檢測IFN-γ分泌。

圖D-F為預(yù)防性肺轉(zhuǎn)移B16F10黑色素瘤模型的抗腫瘤效果，小鼠接受三次免疫后，尾靜脈注射B16F10細胞，20天后處死小鼠并觀察肺部轉(zhuǎn)移灶(E)和數(shù)量(F)。

圖G-J為FACS分析，評估免疫后小鼠脾細胞中T細胞的分化比例，包括CD4+ T細胞(G)、CD8+ T細胞(H)、效應(yīng)記憶T細胞(TEM，I)和中央記憶T細胞(TCM，J)的比例。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，統(tǒng)計顯著性通過單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較法計算。

圖6：GP-M25在4T1乳腺癌模型中誘導(dǎo)的M25特異性細胞免疫反應(yīng)和抗腫瘤活性

圖A-C為ELISPOT和ELISA分析，顯示M25特異性CD8+ T細胞的IFN-γ分泌情況。BALB/c小鼠接受M25或GP-M25聯(lián)合或不聯(lián)合CpG 2395免疫兩次后，脾細胞分別用M25再刺激后進行ELISPOT分析(A)，以及用M25或CM35再刺激后進行ELISA分析(B和C)。

圖D-F為預(yù)防性4T1模型的抗腫瘤效果，小鼠接受三次免疫后，皮下注射4T1細胞，觀察腫瘤生長曲線(E)和腫瘤浸潤性淋巴細胞中CD4+和CD8+ T細胞的比例(F)。數(shù)據(jù)以均值±標準誤表示，統(tǒng)計顯著性通過單因素方差分析(ANOVA)和Tukey多重比較法計算。

研究結(jié)論

本研究開發(fā)了一種基于β-1,3-葡聚糖顆粒(GPs)的肽段新抗原疫苗系統(tǒng)(GP-Neoantigen)，用于腫瘤免疫治療。研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)能夠高效負載腫瘤特異性新抗原肽，并被抗原呈遞細胞(APCs)特異性攝取和降解，激活免疫反應(yīng)。在多種小鼠腫瘤模型中，GP-Neoantigen顯著抑制了腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，尤其是與免疫佐劑(如PolyI:C和CpG 2395)聯(lián)合應(yīng)用時，部分小鼠實現(xiàn)了腫瘤完全清除。此外，該系統(tǒng)誘導(dǎo)了特異性的CD8+ T細胞和體液免疫反應(yīng)，增強了免疫記憶，并表現(xiàn)出良好的生物安全性和穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明，GP-Neoantigen系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中具有巨大潛力，未來有望進一步優(yōu)化并應(yīng)用于臨床。