同源異體小鼠腫瘤模型是免疫腫瘤學(I/O)研究中不可或缺的臨床前模型，但它們對免疫檢查點抑制劑(ICIs)的反應(yīng)有限，這可能是由于它們的固有低免疫原性。為了解決這一問題，研究人員通過將雞卵清蛋白(OVA)這一高度免疫原性的蛋白質(zhì)表達到同源異體腫瘤細胞中，開發(fā)了新的免疫原性同源異體模型。這些模型，如DC2.4-OVA和B16-OVA，顯示出比它們的親本細胞系更慢的腫瘤生長速度，這可能是由于免疫介導的排斥反應(yīng)。更重要的是，這些OVA表達的模型對ICIs，特別是抗PD-1治療，表現(xiàn)出更高的敏感性，這表明它們在增強T細胞介導的免疫反應(yīng)方面具有潛力。此外，通過過繼T細胞轉(zhuǎn)移實驗，研究人員驗證了這些模型中存在腫瘤特異性記憶T細胞。這些結(jié)果表明，OVA工具細胞不僅增強了對ICIs的反應(yīng)，而且為臨床前免疫治療評估提供了新的、具有更高免疫原性的同源異體模型，這對于I/O研究具有重要的意義。

基本信息

英文標題：CXCR4 inhibition modulates the tumor microenvironment and retards the growth of B16-OVA melanoma and Renca tumors

中文標題：CXCR4抑制可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境并延緩B16-OVA黑色素瘤和Renca腫瘤的生長

發(fā)表期刊：《Front Endocrinol》

影響因子：3.9

作者單位：

1.Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

2.Department of Spine Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

3.Key Laboratory of Liver Disease of Guangdong Province, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

作者信息：Yuzhen Zhang, Yutian Chong, Liang Peng, Fangji Yang, Wenxiong Xu, Lina Wu, Luo Yang, Shu Zhu, Lu Wang, Wenbin Wu

研究背景

黑色素瘤是一種潛在的侵襲性、致命的癌癥，近年來雖有多種新的治療方式出現(xiàn)，如針對BRAFV600E突變和MEK的靶向治療以及免疫檢查點抑制劑等，但大多數(shù)患者僅能獲得部分緩解，仍需額外或替代的治療方法。CXCR4是一種G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，表達于多種細胞類型，包括T淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞和內(nèi)皮細胞等。它在與配體CXCL12結(jié)合后會觸發(fā)多條下游信號傳導通路，從而影響細胞增殖、遷移、存活等過程。研究表明，CXCR4在多種實體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中過表達，且在黑色素瘤中其表達水平與疾病死亡風險相關(guān)，是獨立的預后因素。CXCR4在癌細胞生存和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，可能通過激活促生存信號使癌細胞對免疫攻擊產(chǎn)生抵抗。此外，CXCR4對于癌細胞向表達CXCL12的器官轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它使腫瘤細胞能夠進入支持其生存和生長的細胞微環(huán)境，如骨髓、肝臟、肺和淋巴結(jié)等。

研究方法

本研究使用了B16黑色素瘤細胞(H2b)和Renca腎癌細胞系進行實驗。B16-OVA細胞由Dr. Ben Izar提供，Renca DM細胞由Dr. Gordon Freeman提供。細胞在含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和50 pg/mL慶大霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實驗使用了6-8周齡的C57BL/6和Balb/c雌性小鼠，分別皮下接種B16-OVA或Renca DM細胞。在腫瘤達到一定直徑后開始治療，分為多個組，分別給予不同藥物處理，包括X4-136、抗PD-L1、抗PD-1、阿西替尼等，以及它們的聯(lián)合用藥。治療期間腫瘤體積通過公式V=(最小直徑)×最大直徑/2計算。實驗結(jié)束后，腫瘤組織被切除用于Western blot分析、實時定量PCR和流式細胞術(shù)檢測。RNA提取使用Purelink RNA Minikit，cDNA制備使用Reverse Transcriptase Mix，實時定量PCR使用Taqman探針。Western blot檢測了p-Akt、Akt、p-FOXO-3a、FOXO-3a、cyclin D1、IDO1和B-Actin等蛋白。流式細胞術(shù)檢測了CD3、CD8a、穿孔素、Gr-1、CD11b、FOXP3、CD25、CD4等免疫細胞標志物，以及H-2Kb/SINFEKL四聚體用于檢測OVA特異性CD8 T細胞。統(tǒng)計分析使用Graph Pad Prism軟件，通過單因素方差分析和學生t檢驗計算組間差異，p值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

實驗結(jié)果

圖1：X4-136及免疫檢查點抑制劑抗體對同系B16-OVA黑色素瘤生長的影響

小鼠分別單獨或聯(lián)合接受X4-136、抗PD-1、抗PD-L1或抗CTLA-4+抗PD-L1治療，如圖所示。腫瘤生長以均值±標準誤(n=5-6)繪制。

圖2：X4-136和免疫檢查點抑制劑抗體對腫瘤微環(huán)境中細胞浸潤的影響

經(jīng)過16天的治療后，收獲并消化黑色素瘤組織。通過流式細胞術(shù)分析單細胞懸浮液，檢測以下免疫細胞群體：(a)CD3+細胞，(b)CD8+細胞，(c)CD8+穿孔素+淋巴細胞，(d)OVA特異性CD8+淋巴細胞，即結(jié)合PE標記的H-2Kb/SINFEKL四聚體的CD8+淋巴細胞，(e)髓系來源的抑制細胞(MDSC)，和(f)調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)。結(jié)果顯示為相對于對照組的細胞數(shù)量變化倍數(shù)，并以均值±標準誤(n=5-6)表示。

圖3：X4-136單獨或聯(lián)合免疫檢查點抑制劑對免疫相關(guān)基因表達的影響

X4-136單獨或與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用可抑制CTLA-4、IDO-1和Foxp3 mRNA的表達，并增加顆粒酶B的表達。從腫瘤組織中提取總RNA，并使用特異性探針分析(a)CTLA-4，(b)顆粒酶B，(c)Foxp3和(d)IDO-1的表達。結(jié)果顯示為相對于對照組的特定mRNA水平變化倍數(shù)，并以均值±標準誤(n=3)表示。(e)從分離的黑色素瘤中制備全細胞裂解物，并通過Western blot使用特異性抗體分析IDO-1的表達，以β-actin作為加載對照。

圖4：X4-136與免疫檢查點抑制劑對Akt/FOXO-3a通路的影響

X4-136單獨或與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用對Akt/FOXO-3a通路的影響。從分離的黑色素瘤或處理過的細胞中制備全細胞裂解物，并使用特異性抗體檢測各種蛋白的表達，以β-actin作為加載對照。

圖5：X4-136與阿西替尼在Renca-D腎癌模型中的效果

在Renca-D腎癌模型中，小鼠分別接受X4-136、阿西替尼單獨或聯(lián)合治療。腫瘤生長以均值±標準誤(n=5-6)繪制。治療8天后，收獲腫瘤并制備單細胞懸浮液，通過流式細胞術(shù)分析(b)CD3+細胞，(c)CD8+細胞，(d)CD8+穿孔素+淋巴細胞，(e)髓系來源的抑制細胞(MDSC)，和(f)調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)。結(jié)果顯示為相對于對照組的細胞數(shù)量變化倍數(shù)，并以均值±標準誤(n=5-6)表示。

研究結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4抑制劑X4-136單獨使用或與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用，均能顯著抑制B16-OVA黑色素瘤的生長。X4-136單獨使用時，腫瘤生長抑制效果優(yōu)于單獨使用抗PD-1或抗PD-L1抗體。與抗PD-L1抗體聯(lián)合使用時，可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效果，但與抗PD-1或抗CTLA-4+抗PD-L1聯(lián)合使用時未觀察到協(xié)同效果。X4-136單獨使用或與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用，均能顯著增加腫瘤微環(huán)境中CD3+細胞和CD8+細胞的浸潤，尤其是激活的CD8+穿孔素+淋巴細胞的數(shù)量顯著增加，這表明CXCR4抑制增強了T細胞的活性。此外，X4-136還能減少腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細胞群體，如髓系來源的抑制細胞(MDSC)和調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)。在黑色素瘤模型中，CXCR4抑制還導致CTLA-4、IDO-1和Foxp3 mRNA水平的降低，以及顆粒酶B表達的增加。在Renca-DM腎癌模型中，X4-136單獨使用或與抗VEGFR藥物阿西替尼聯(lián)合使用，均能顯著抑制腫瘤生長，且聯(lián)合使用時效果更佳。這些結(jié)果表明，CXCR4抑制劑X4-136具有顯著的抗腫瘤活性，且與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用時可進一步增強其效果。