Fluc細(xì)胞是經(jīng)過基因工程改造后能夠表達(dá)螢火蟲熒光素酶的細(xì)胞，因其高靈敏度、低背景干擾、蛋白穩(wěn)定性強(qiáng)和耐熱性而在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)中被廣泛應(yīng)用。這些細(xì)胞不僅能夠用于驗證miRNA與mRNA、lncRNA、circRNA之間的相互作用，還能動態(tài)監(jiān)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，以及研究CAR-T細(xì)胞治療的效果。Fluc細(xì)胞的高靈敏度和穩(wěn)定性減少了對樣本的侵入性，保持了細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)，而其快速反應(yīng)和低背景發(fā)光特性，預(yù)示著在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)luc細(xì)胞的應(yīng)用將進(jìn)一步擴(kuò)展，為疾病研究和治療提供更多可能性。

基本信息

英文標(biāo)題：Molecular imaging with bioluminescence and PET reveals viraloncolysis kinetics and tumor viability

中文標(biāo)題：生物發(fā)光和PET分子成像揭示病毒溶瘤動力學(xué)和腫瘤活性

發(fā)表期刊：《Cancer Res》

影響因子：12.5

作者單位：

1.Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Boston, MA

2.Department of Radiology, Massachusetts General Hospital, Boston, MA

作者信息：

Darshini Kuruppu, Anna-Liisa Brownell, Khalid Shah, Umar Mahmood, Kenneth K. Tanabe

研究背景

病毒溶瘤，即通過復(fù)制病毒破壞癌細(xì)胞，是一種仍在探索中的實驗性癌癥治療方法。這種療法的治療范式涉及在癌細(xì)胞中連續(xù)的溶裂復(fù)制波。目前，監(jiān)測復(fù)制位點的病毒滴度需要活檢。然而，重復(fù)的連續(xù)活檢在實際中并不可行，無法用于患者體內(nèi)病毒復(fù)制和腫瘤反應(yīng)的時間監(jiān)測。分子成像提供了一種非侵入性方法，可以實時識別細(xì)胞內(nèi)的病毒基因表達(dá)。本研究通過生物發(fā)光和正電子發(fā)射斷層掃描(PET)順序成像病毒溶瘤和腫瘤對溶瘤的反應(yīng)，揭示了腫瘤異種移植物中這兩個過程的動力學(xué)。研究結(jié)果表明，病毒復(fù)制周期可以被識別為在初始病毒腫瘤感染高峰后約2天出現(xiàn)的連續(xù)報告基因表達(dá)波。這些波對應(yīng)于復(fù)制周期后釋放的病毒顆粒。病毒和細(xì)胞動力學(xué)分別通過Fluc和Rluc生物發(fā)光報告基因以及兩種18F標(biāo)記的PET報告基因(FHBG，9-(4-18F-氟-3-[羥甲基]丁基)鳥嘌呤)和(FLT，18F-3'-脫氧-3-氟胸苷)進(jìn)行成像。對腫瘤異種移植物切片的關(guān)聯(lián)免疫組化確認(rèn)了體內(nèi)結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，PET可以用于識別病毒復(fù)制周期，并實時測量腫瘤內(nèi)復(fù)制病毒的水平。這種非侵入性成像方法在監(jiān)測患者體內(nèi)的病毒溶瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價值。

研究方法

本研究開發(fā)了用于生物發(fā)光成像的穩(wěn)定細(xì)胞系，通過慢病毒載體將Rluc和mCherry基因及嘌呤霉素抗性基因?qū)肴祟惡托∈蟀┌Y細(xì)胞系。細(xì)胞系經(jīng)過認(rèn)證和污染檢測，通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)Rluc的細(xì)胞株。同時，研究生成了表達(dá)Fluc的復(fù)制條件HSV-1突變體HSV-Luc，用于體外和體內(nèi)病毒復(fù)制的生物發(fā)光成像。通過熒光素酶和[18F]FHBG-PET測量病毒復(fù)制，建立了側(cè)腹腫瘤模型，并利用雙重Fluc和Rluc生物發(fā)光及microPET技術(shù)對病毒和腫瘤進(jìn)行體內(nèi)成像。此外，通過LacZ染色和免疫組化方法在冷凍腫瘤切片中識別病毒，評估了HSV-TK、PCNA表達(dá)以及細(xì)胞凋亡情況。這些方法為監(jiān)測病毒溶瘤治療提供了非侵入性成像手段。

實驗結(jié)果

圖1：分子報告基因、細(xì)胞和病毒的示意圖特征

A部分：雙重生物發(fā)光檢測系統(tǒng)基于Fluc和Rluc的酶促反應(yīng)，其中熒光素和coelenterazine分別作為底物。PET配體[18F]FHBG作為HSV-TK的底物，被磷酸化并困在細(xì)胞內(nèi)。

B部分：表達(dá)Rluc和mCherry的穩(wěn)定癌細(xì)胞系可以通過Rluc生物發(fā)光和mCherry熒光進(jìn)行識別。圖中展示了體外成像Rluc的轉(zhuǎn)化MC26細(xì)胞。C部分：HSV-Luc表達(dá)Fluc和TK基因。在體外，通過Fluc生物發(fā)光在C26細(xì)胞中識別復(fù)制的病毒(MC26+HSV-Luc)，其信號與瞬時表達(dá)Fluc的MC26細(xì)胞(MC26-Fluc)相當(dāng)。通過PET示蹤劑[18F]FHBG在體外檢測MC26細(xì)胞中復(fù)制的病毒(MC26+hrR3)，其信號與瞬時表達(dá)TK基因的MC26細(xì)胞(MC26sr39TK)相當(dāng)。

圖2：體外病毒和細(xì)胞動力學(xué)研究

A部分：研究了HSV-Luc在MC26細(xì)胞中的復(fù)制動力學(xué)，使用Fluc生物發(fā)光進(jìn)行檢測。在高病毒滴度(1×108、1×107和1×106 pfu)時，F(xiàn)luc信號出現(xiàn)了兩個峰值(箭頭所示)，而在低病毒滴度下信號無法檢測。Fluc信號以平均凈強(qiáng)度/面積±標(biāo)準(zhǔn)差表示。B部分：研究了病毒感染后MC26細(xì)胞的存活率。當(dāng)用高病毒滴度(1×108、1×107和1×106 pfu)感染時，細(xì)胞計數(shù)減少。細(xì)胞計數(shù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。C部分：展示了HSV-Luc(1×108 pfu)感染后24小時MC26細(xì)胞和Vero細(xì)胞對[18F]FHBG的攝取情況。數(shù)據(jù)以[18F]FHBG攝取/細(xì)胞的平均百分比±標(biāo)準(zhǔn)差表示。D部分：研究了病毒感染后MC26細(xì)胞和Vero細(xì)胞濃度的變化。與未感染病毒的細(xì)胞相比，MC26細(xì)胞濃度顯著降低。細(xì)胞濃度以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

圖3：病毒復(fù)制動力學(xué)的體內(nèi)成像研究

A部分：研究了側(cè)腹腫瘤中病毒復(fù)制的動力學(xué)，使用熒光素酶(Fluc)生物發(fā)光技術(shù)。Fluc信號表現(xiàn)出3個峰值(箭頭所示)，這些峰值隨時間逐漸減弱。Fluc信號以每單位面積的平均凈強(qiáng)度加標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

B部分：則通過[18F]FHBG-PET成像技術(shù)研究病毒復(fù)制的動力學(xué)。在高病毒滴度(1×108 pfu)的情況下，腫瘤對[18F]FHBG的攝取在6小時(0.3天)達(dá)到峰值(箭頭所示)，隨后逐漸下降。而在較低病毒滴度(1×106 pfu)的情況下，[18F]FHBG攝取在3天時再次達(dá)到峰值。最低病毒滴度(1×103 pfu)則未檢測到信號。放射性標(biāo)記攝取以每單位體積注射劑量的百分比的平均值加標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

圖4：Rluc生物發(fā)光成像的腫瘤生長與卡尺測量體積的相關(guān)性

在雙側(cè)MDA-MB-231-Rluc側(cè)腹腫瘤的掃描圖像中，Rluc信號區(qū)域隨時間增加(A)。Rluc信號強(qiáng)度增強(qiáng)，并與卡尺測量的腫瘤體積相對應(yīng)(B)。在A2058-Rluc(C，D)和HT29-Rluc(E，F(xiàn))側(cè)腹腫瘤中也觀察到類似的現(xiàn)象，即Rluc信號的增加與卡尺測量的腫瘤體積相關(guān)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。

圖5：腫瘤生長和病毒復(fù)制動力學(xué)的雙生物發(fā)光成像研究

圖A：顯示了通過Rluc成像的MDA-MB-231-Rluc側(cè)腹腫瘤的生長情況。圖B：展示了經(jīng)過病毒溶瘤治療(1×108 pfu)的MDA-MB-231-Rluc腫瘤的生長抑制情況，同樣通過Rluc成像。圖C：顯示了對照組和病毒處理組的Rluc信號強(qiáng)度，Rluc信號以平均凈強(qiáng)度/面積 ± SD表示，星號表示P<0.004。圖D：顯示了通過卡尺測量的對照組和病毒處理組的腫瘤體積，腫瘤體積以平均值 ± SD表示，星號表示P<0.002。圖E：展示了通過Fluc成像的病毒復(fù)制的順序成像。圖F：顯示了Fluc信號強(qiáng)度隨時間的變化，F(xiàn)luc信號以平均凈強(qiáng)度/面積 ± SD表示，箭頭表示信號強(qiáng)度多次達(dá)到峰值后逐漸下降。

圖6：微PET成像下的病毒復(fù)制與細(xì)胞增殖動態(tài)：[18F]FHBG-PET與[18F]FLT-PET的應(yīng)用

研究中，病毒被注射到雙側(cè)腹股溝腫瘤的左側(cè)。通過[18F]FHBG-PET成像，發(fā)現(xiàn)[18F]FHBG在病毒感染的腫瘤中被攝取，而在對照腫瘤中則沒有攝取。動態(tài)PET掃描后的時間-活性曲線顯示，[18F]FHBG在病毒感染的腫瘤中積累，而在心臟、肝臟和對照腫瘤中則被清除。此外，通過[18F]FLT-PET成像識別出增殖的腫瘤，光子缺乏區(qū)域標(biāo)識了腫瘤核心中的病毒復(fù)制位點。

圖7：體外生物發(fā)光、熒光和微PET成像數(shù)據(jù)的相關(guān)性

A部分：顯示了病毒注射前腫瘤的特征，通過Rluc生物發(fā)光、mCherry熒光和[18F]FLT-PET(小箭頭)識別腫瘤。H&E和PCNA顯示體外高度增殖的腫瘤。

B部分：顯示了溶裂病毒復(fù)制后腫瘤特征的變化，48小時后通過Rluc、mCherry和[18F]FLT-PET(箭頭)識別出破壞的腫瘤核心，H&E和PCNA顯示破壞的腫瘤核心(箭頭)被存活的腫瘤邊緣(星號)包圍。

C部分：通過Fluc生物發(fā)光和[18F]FHBG-PET識別出復(fù)制的病毒。IHC染色用于LacZ和HSV-TK(切除腫瘤中的箭頭)確認(rèn)病毒的存在，破壞的腫瘤核心中觀察到凋亡。

研究結(jié)論

本研究通過生物發(fā)光和PET成像技術(shù)成功檢測了穩(wěn)定表達(dá)mCherry和Rluc的細(xì)胞系以及復(fù)制條件HSV-1突變體HSV-Luc。體外實驗中，F(xiàn)luc生物發(fā)光信號與病毒滴度相關(guān)，高滴度(1×108 pfu)感染后18小時和30小時出現(xiàn)兩個峰值，對應(yīng)病毒復(fù)制周期。低滴度(1×103至1×105 pfu)則無法檢測到，細(xì)胞計數(shù)隨時間增加。體內(nèi)實驗中，通過生物發(fā)光和PET成像研究了HSV-1在攜帶腫瘤異種移植物的小鼠中的復(fù)制動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Fluc信號隨時間出現(xiàn)峰值，與病毒釋放后的復(fù)制周期相符。通過雙重Fluc和Rluc生物發(fā)光成像研究了HSV-Luc感染腫瘤后的病毒復(fù)制和腫瘤反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)病毒處理組Rluc表達(dá)區(qū)域隨時間減少，F(xiàn)luc信號在病毒注射后6小時達(dá)到峰值，隨后每2天出現(xiàn)一次峰值，表明新釋放的病毒顆粒。這些結(jié)果表明，生物發(fā)光和PET成像技術(shù)可以有效監(jiān)測病毒溶瘤治療的效果。