乙肝病毒(HBV)感染是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，有超過2.5億人慢性感染HBV。而其中有超三分之一的人口集中在我國，人數接近1億人。NTCP工具細胞，特別是外源表達NTCP的肝癌細胞系如HepG2-NTCP和Huh7-NTCP，因其易操作、短周期、重現性佳的特點，在乙肝病毒(HBV)研究中扮演著至關重要的角色。這些細胞模型能夠有效模擬HBV的感染過程，為研究HBV的生命周期、宿主限制因子、病毒復制以及藥物篩選提供了一個強大而便捷的體外平臺。它們不僅有助于揭示HBV感染的分子機制，如DDX3作為宿主限制因子阻礙cccDNA轉錄，GPC5作為附著因子在感染入胞過程中的作用，還能通過直接與NTCP相互作用或下調NTCP表達來篩選和驗證抗病毒藥物的活性，例如環(huán)孢菌素A及其衍生物、雷帕霉素及其衍生物等。此外，這些工具細胞還促進了對HBV宿主特異性分子的發(fā)現，為發(fā)展支持HBV感染的小動物模型提供了可能，這對于乙肝相關研究和藥物開發(fā)具有重大意義。

基本信息

英文標題：NTCP Deficiency Affects theLevels of Circulating Bile Acidsand Induces Osteoporosis

中文標題：NTCP缺乏影響循環(huán)膽汁酸水平并誘導骨質疏松癥

發(fā)表期刊：《Front Endocrinol》

影響因子：3.9

作者單位

1.Department of Infectious Diseases, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

2.Department of Spine Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

3.Key Laboratory of Liver Disease of Guangdong Province, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.

作者信息

Yuzhen Zhang, Yutian Chong, Liang Peng, Fangji Yang, Wenxiong Xu, Lina Wu, Luo Yang, Shu Zhu, Lu Wang, Wenbin Wu

研究背景

NTCP由SLC10A1基因編碼，是膽汁酸轉運蛋白及乙肝病毒和丁肝病毒的細胞受體。它在膽汁酸的腸肝循環(huán)中起關鍵作用，其缺乏會導致血液中膽汁酸水平升高。2015年首次報道了因基因突變導致的NTCP缺乏癥，此后發(fā)現該病癥常表現為高膽汁酸血癥，但具體表型特征和長期預后尚不明確。本研究旨在描述NTCP缺乏的表型特征、膽汁酸譜變化，并評估其長期預后。

研究方法

本研究納入了10名p.Ser267Phe SLC10A1突變的純合子個體、20名雜合子個體及20名健康野生型志愿者，所有參與者均簽署知情同意書，項目獲倫理委員會批準。此外，還生成了NTCP敲除小鼠模型，小鼠在標準條件下飼養(yǎng)，部分雌性小鼠進行了卵巢切除術，動物使用獲相關委員會批準。研究分析了受試者的臨床參數，包括血清中總膽汁酸水平、肝功能、血脂和維生素水平，以及小鼠血清中的骨保護素和核因子κB配體受體激活劑水平。利用UPLC-MS/MS系統(tǒng)對人類和小鼠血清樣本中的膽汁酸進行高通量譜分析和定量。通過微CT成像和組織學分析評估小鼠骨骼狀況。數據以均值±標準差或中位數及四分位數表示，組間差異通過Kruskal-Wallis檢驗、學生t檢驗或方差分析進行分析，p值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義，圖表使用GraphPad Prism 6.0或R編程語言生成。

實驗結果

圖1：兩名純合子個體的腰椎和股骨頸的DXA掃描結果

38歲的男性純合子個體(A-D)，腰椎(L1-L4)和股骨頸的Z分數分別為-3.0和-1.9，DXA診斷為骨量減少。在隨訪中，腰椎和股骨頸的Z分數分別降至-3.3和-2.2。47歲的女性純合子個體(E-H)，腰椎(L1-L4)和股骨頸的T分數分別為-2.6和-1.7，DXA診斷也為骨量減少。在隨訪中，腰椎和股骨頸的T分數分別降至-3.1和-2.4。

圖2：p.Ser267Phe突變純合子個體血清中膽汁酸譜的顯著改變

A) 血清中總膽汁酸水平。

B) 使用所有鑒定的膽汁酸對野生型(WT)、雜合子(HET)和純合子(HOM)個體進行主成分分析(PCA)。

C) 血清中25(OH)D3水平。

D) 總初級和次級膽汁酸的比例，以及初級與次級膽汁酸比值的箱線圖。

E) 總結合型和未結合型膽汁酸的比例，以及結合型與未結合型膽汁酸比值的箱線圖。

F) 初級和次級膽汁酸。

G) 血清中未結合型、甘氨結合型和牛磺結合型膽汁酸的濃度。*表示p < 0.05，**表示p < 0.001，***表示p < 0.0001。

圖3：NTCP缺乏對卵巢切除(Ovx)小鼠骨質疏松癥的影響

A) 在建立Ovx或假手術(SHAM)模型后8周內，野生型假手術(WT SHAM)、NTCP敲除假手術(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠的體重變化。B) 和 C) 代表性微計算機斷層掃描(micro-CT)圖像，顯示WT SHAM、KO SHAM、WT Ovx和KO Ovx小鼠股骨的垂直(B)和橫截面(C)。D) NTCP缺乏加劇了Ovx小鼠的骨質疏松癥。指標包括骨體積/組織體積(Bv/Tv)、骨表面積/骨體積(Bs/Bv)、小梁厚度(Tb.Th)、小梁數量(Tb.N)、小梁間距(Tb.Sp)和小梁模式因子(Tb.Pf)，皮質壁厚度(CWT)。每組6只小鼠。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

圖4：NTCP缺乏對卵巢切除(Ovx)小鼠成骨和破骨的影響

(A-C)代表性蘇木精-伊紅(H&E)染色(A)和抗酸性磷酸酶(TRAP)染色(B)的股骨組織切片，來自野生型假手術(WT SHAM)、NTCP敲除假手術(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠。計算了各組中TRAP陽性細胞的比例(C)。(D-F)野生型假手術(WT SHAM)、NTCP敲除假手術(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠的RANKL和OPG水平，以及RANKL與OPG的比值。每組6只小鼠。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001，****表示p < 0.0001。

圖5：NTCP缺乏對小鼠血清中膽汁酸(BAs)水平的影響

(A-D)野生型假手術(WT SHAM)、NTCP敲除假手術(KO SHAM)、野生型卵巢切除(WT Ovx)和NTCP敲除卵巢切除(KO Ovx)小鼠血清中ALT、AST、TBA和25(OH)D3的水平，每組6只小鼠。(E)總初級和次級膽汁酸的比例，以及初級與次級膽汁酸比值的箱線圖。(F)總結合型和未結合型膽汁酸的比例，以及結合型與未結合型膽汁酸比值的箱線圖。(G)初級和次級膽汁酸。(H)血清中未結合型、甘氨結合型和?；墙Y合型膽汁酸的濃度。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

研究結論

本研究對10名攜帶NTCP p.Ser267Phe純合突變的個體進行了5年隨訪，發(fā)現這些個體存在高膽汁酸血癥、維生素D缺乏、骨量減少和膽囊異常，但未出現明顯臨床癥狀。進一步分析顯示，純合子個體血清中總膽汁酸濃度顯著增加，初級和結合型膽汁酸比例升高，25(OH)D3水平降低。此外，NTCP敲除小鼠模型顯示，NTCP缺乏加劇了卵巢切除誘導的骨質疏松，表現為骨量減少和骨吸收增加，且小鼠血清中膽汁酸水平升高，維生素D水平降低，與人類純合子個體的結果一致。