在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域，生物發(fā)光成像技術(shù)因其高信噪比而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞測(cè)定和動(dòng)物成像研究。然而，傳統(tǒng)的熒光素酶種類有限，限制了同時(shí)成像多個(gè)分子和細(xì)胞事件的能力。為了突破這一限制，科學(xué)家們開發(fā)了一種新型的ATP非依賴性熒光素酶——NanoLuc(NL)，它源自深海蝦Oplophorus gracilirostris，并經(jīng)過工程改造以增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。NanoLuc作為一種小型(19 kDa)、高亮度的熒光素酶，其亮度是傳統(tǒng)螢火蟲或海腎熒光素酶的100倍，并且使用furimazine作為底物產(chǎn)生明亮的輝光型發(fā)光。

NanoLuc的意義在于其為雙報(bào)告基因生物發(fā)光分子成像提供了新的可能。它不僅可以在活體小鼠的表層和深層組織中成像，而且其生物發(fā)光隨時(shí)間的變化可以用來定量腫瘤生長，甚至在少量血清中也能檢測(cè)到分泌的NL。此外，NanoLuc與螢火蟲熒光素酶的結(jié)合使用，為在完整細(xì)胞和活體小鼠中定量TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的兩個(gè)關(guān)鍵步驟提供了一種新型雙熒光素酶成像策略，從而在正常生理、疾病和藥物開發(fā)中擴(kuò)展了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成像能力。NanoLuc的作用不僅體現(xiàn)在其高靈敏度和高穩(wěn)定性上，它還具有更小的尺寸，這使得在標(biāo)記細(xì)胞和蛋白質(zhì)時(shí)對(duì)樣本的侵入性更小，有助于保持細(xì)胞或組織的天然狀態(tài)。NanoLuc的快速反應(yīng)、低背景發(fā)光和多樣靈活等特點(diǎn)，使其在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，NanoLuc作為一種新的報(bào)告基因，不僅增強(qiáng)了我們對(duì)生物過程的理解和疾病機(jī)理的研究，而且在開發(fā)潛在治療方法和療法方面發(fā)揮了重要作用。

基本信息

英文標(biāo)題：Oxygen imaging of hypoxic pockets in the mouse cerebral cortex

中文標(biāo)題：小鼠大腦皮層缺氧區(qū)域的氧氣成像

發(fā)表期刊：《SCIENCE》

影響因子：44.7

作者單位

1.Division of Glial Disease and Therapeutics, Center for Translational Neuromedicine, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2200 Copenhagen, Denmark.

2.School of Engineering, FHNW University of Applied Sciences and Arts Northwestern Switzerland, 5210 Windisch, Switzerland.

3.Division of Glial Disease and Therapeutics, Center for Translational Neuromedicine, University of Rochester Medical Center, Rochester, NY 14642, USA.

作者信息：Felix R. M. Beinlich, Antonios Asiminas, Verena Untiet, Zuzanna Bojarowska, Virginia Plá, Bj?rn Sigurdsson, Vincenzo Timmel, Lukas Gehrig, Michael H. Graber, Hajime Hirase, Maiken Nedergaard.

研究背景

意識(shí)在腦血流停止后幾秒內(nèi)喪失，大腦無法儲(chǔ)存氧氣，氧化磷酸化的中斷幾分鐘內(nèi)致命。大腦的高代謝率和氧氣消耗使其特別容易受到氧化應(yīng)激的影響，這種應(yīng)激在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。然而，目前對(duì)于生理?xiàng)l件下大腦皮層局部氧分壓(Poz)動(dòng)態(tài)變化的了解還非常有限，主要由于缺乏空間精確的Poz成像測(cè)量技術(shù)。

研究方法

研究者們通過在野生型小鼠的大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)Green enhanced Nano-lantern (GeNL)，并局部給予底物furimazine，測(cè)量生物發(fā)光強(qiáng)度(BLI)，以評(píng)估GeNL在檢測(cè)局部氧分壓(PO2)動(dòng)態(tài)變化中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)中，通過逐步改變呼吸空氣中的氧氣濃度，并使用O2敏感的Clark型微電極校準(zhǔn)BLI，記錄絕對(duì)PO2值。此外，研究者們還排除了pH變化對(duì)BLI的影響，通過在表達(dá)pH傳感器的小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在清醒活動(dòng)的小鼠中，通過空氣噴射刺激胡須，測(cè)試BLI是否能檢測(cè)到感覺誘導(dǎo)的皮層PO2變化。連續(xù)成像BLI揭示了休息條件下局部短暫的PO2下降事件，稱為“缺氧區(qū)域”，并記錄了這些區(qū)域的數(shù)量、面積、持續(xù)時(shí)間和幅度。研究還評(píng)估了血管擴(kuò)張(通過高碳酸血癥和異氟醚麻醉)和毛細(xì)血管停滯(通過注射微球)對(duì)缺氧區(qū)域的影響。最后，通過訓(xùn)練小鼠耐受頭部固定，比較了清醒靜止和運(yùn)動(dòng)小鼠的缺氧區(qū)域變化，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)顯著減少了缺氧區(qū)域的負(fù)擔(dān)。這些實(shí)驗(yàn)方法綜合評(píng)估了GeNL在檢測(cè)小鼠大腦皮層局部氧分壓動(dòng)態(tài)變化中的應(yīng)用，特別是在清醒活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)條件下的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1：Green enhanced Nano-lantern(GeNL)的生物發(fā)光強(qiáng)度(BLI)如何報(bào)告大腦局部氧分壓(PO2)

實(shí)驗(yàn)中，KX麻醉的小鼠在膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動(dòng)子下表達(dá)GeNL，被放置在宏觀鏡下，并暴露于不同濃度的氧氣中。一個(gè)O2敏感的微電極通過急性開顱手術(shù)插入皮層，并補(bǔ)充含furimazine(0.25 mM)的人工腦脊液。在O2存在下，furimazine在GeNL的催化下轉(zhuǎn)化為furimamide，產(chǎn)生生物發(fā)光。BLI和mNeonGreen熒光的疊加圖像顯示了開顱和氧敏感微電極的位置。BLI隨吸入氧氣濃度的變化而變化，單幀圖像(1秒曝光時(shí)間)在不同氧氣濃度下顯示了BLI的變化。BLI和PO2的平均變化軌跡顯示了在不同氧氣濃度下BLI和PO2的變化，陰影區(qū)域表示標(biāo)準(zhǔn)誤差。當(dāng)吸入氧氣濃度翻倍時(shí)，BLI強(qiáng)度變化162%(±19.13，SEM)，10%的氧氣增加導(dǎo)致BLI增加66%(±6.70)，而在缺氧條件下，BLI減少了29%(±2.91)。相應(yīng)地，當(dāng)氧氣濃度翻倍時(shí)，PO2增加了52.4 mmHg(±2.4)，10%的氧氣增加使PO2增加了18.6 mmHg(±1.9)，10%的減少使PO2減少了9.7 mmHg(±1.6)。通過方差分析(ANOVA)和Tukey事后檢驗(yàn)，不同氧氣濃度下的BLI和PO2變化具有顯著性差異。BLI的變化與O2電極記錄的PO2變化呈線性關(guān)系，決定系數(shù)R2為0.82。在清醒、靜止、頭部固定的小鼠中，通過BLI測(cè)量了體感皮層的PO2，并在胡須刺激下觀察了PO2的變化。在每次10次重復(fù)的胡須刺激期間，PO2均升高，均值±SEM被展示出來，***P < 0.001，****P < 0.0001。[(D)至(F)]來自六只小鼠的9次試驗(yàn)。a.u.，任意單位。比例尺，100毫米。

圖2：研究者們通過生物發(fā)光強(qiáng)度(BLI)成像技術(shù)，對(duì)KX麻醉小鼠的大腦體感皮層進(jìn)行了20分鐘的局部氧分壓(PO2)成像

結(jié)果顯示，大腦皮層中存在局部短暫的PO2下降事件，稱為“缺氧區(qū)域”。這些缺氧區(qū)域在空間上受限，持續(xù)時(shí)間從幾秒到幾分鐘不等，通常表現(xiàn)出相對(duì)組織PO2的銳利起始和結(jié)束。研究者們通過手動(dòng)繪制圓形區(qū)域(ROI)來識(shí)別這些缺氧區(qū)域，并記錄了它們的數(shù)量、面積、持續(xù)時(shí)間和幅度。在20分鐘的記錄中，每只小鼠平均檢測(cè)到200±22個(gè)缺氧區(qū)域，每個(gè)ROI每分鐘平均發(fā)生0.15±0.01次缺氧區(qū)域，意味著大約每7分鐘在同一位置發(fā)生一次。缺氧區(qū)域的平均直徑為45.29±0.31微米，形狀接近圓形。這些缺氧區(qū)域的特征包括負(fù)幅度、銳利的起始和結(jié)束、清晰的邊緣和長持續(xù)時(shí)間。研究還發(fā)現(xiàn)，缺氧區(qū)域的PO2變化與低氧閾值(≤18 mmHg)相似，表明這些區(qū)域確實(shí)達(dá)到了缺氧狀態(tài)。此外，缺氧區(qū)域的分布和特征在不同小鼠之間表現(xiàn)出一定的變異性，但總體上顯示出一致的模式。這些結(jié)果為理解大腦皮層在生理?xiàng)l件下的氧動(dòng)態(tài)提供了重要見解。

圖3：血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管停滯對(duì)麻醉小鼠大腦皮層缺氧區(qū)域的影響

實(shí)驗(yàn)中，KX麻醉小鼠在急性開顱后暴露于10% CO2的吸入空氣中10分鐘，測(cè)量大腦局部氧分壓(PO2)。結(jié)果顯示，高碳酸血癥期間，缺氧區(qū)域的數(shù)量和覆蓋面積顯著減少，而PO2顯著增加。具體來說，高碳酸血癥期間，每平方毫米的缺氧區(qū)域數(shù)量從3.9±0.1減少到2.3±0.1，覆蓋面積從1.01%減少到0.47%。此外，缺氧區(qū)域的持續(xù)時(shí)間和幅度也有所減少。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，通過向小鼠體內(nèi)注射4微米的微球誘導(dǎo)毛細(xì)血管停滯，同時(shí)使用混合BLI-熒光顯微鏡同時(shí)成像BLI和微球熒光。結(jié)果顯示，微球注射后，缺氧區(qū)域的數(shù)量減少，但覆蓋面積增加，表明缺氧區(qū)域可能融合在一起。微球引起的缺氧區(qū)域持續(xù)時(shí)間縮短，但幅度和大小顯著增加。這些結(jié)果表明，血管擴(kuò)張通過增加組織PO2減少缺氧區(qū)域，而毛細(xì)血管停滯則直接引發(fā)缺氧區(qū)域的形成，為理解大腦皮層氧動(dòng)態(tài)提供了重要見解。

圖4：研究了不同覺醒水平對(duì)小鼠大腦皮層缺氧區(qū)域的影響

實(shí)驗(yàn)中，分別在KX麻醉小鼠、清醒固定頭部的小鼠(處于安靜覺醒狀態(tài))以及在聚苯乙烯球上自愿運(yùn)動(dòng)的小鼠中測(cè)量大腦局部氧分壓(PO2)。結(jié)果顯示，與KX麻醉小鼠相比，清醒靜止小鼠的缺氧區(qū)域數(shù)量減少了17%，而運(yùn)動(dòng)小鼠的缺氧區(qū)域數(shù)量進(jìn)一步減少了35%。此外，運(yùn)動(dòng)小鼠的缺氧區(qū)域覆蓋面積比靜止小鼠減少了33%，持續(xù)時(shí)間縮短了7秒，幅度也有所降低。這些結(jié)果表明，覺醒水平的提高，尤其是運(yùn)動(dòng)，顯著減少了大腦皮層的缺氧區(qū)域負(fù)擔(dān)。具體來說，運(yùn)動(dòng)小鼠的缺氧區(qū)域負(fù)擔(dān)比安靜覺醒小鼠減少了52%。這些發(fā)現(xiàn)表明，運(yùn)動(dòng)通過增加腦血流和組織氧分壓，顯著減少了大腦皮層的缺氧區(qū)域，為理解大腦氧動(dòng)態(tài)提供了重要見解。