外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)是外周血(即除骨髓以外的血液)中具有單個(gè)核的細(xì)胞的混合細(xì)胞群體，包括自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)、T淋巴細(xì)胞(70%-90%)、B淋巴細(xì)胞。能夠進(jìn)一步分離純化，是免疫細(xì)胞的主要來源。

外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells ，PBMC)是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，因此在免疫學(xué)、傳染病、惡性腫瘤、疫苗研發(fā)、移植治療、個(gè)性化醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)等領(lǐng)域作為最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)原料被廣泛使用。

PBMC細(xì)胞原理

單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其它細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞的比重超過1.080，單個(gè)核細(xì)胞的比重為1.070左右，血小板為1.030左右。因此，可利用各種血細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重之間的差異將各種血細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離開來。

從血液制備PBMC是分離特定免疫細(xì)胞亞群之前常見的一個(gè)步驟。最常用的PBMC分選方法是使用密度梯度離心液進(jìn)行離心。

Ficoll密度梯度離心法是分離、純化PBMC最常用的方法。Ficoll是蔗糖的多聚體，中性，平均分子量400000，當(dāng)密度為1.2g/mL，未超出正常生理性滲透壓，也不穿過生物膜，故常用作PBMC分離的分離液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大，離心后沉于管底;淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分離液比重，離心后漂浮于分離液的液面上，也可有少部分細(xì)胞懸浮在分離液中。吸取分層液液面上的白膜層細(xì)胞，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)那逑矗涂蓮耐庵苎蟹蛛x到較高純度的單個(gè)核細(xì)胞，即PBMC。

PBMC細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備注意事項(xiàng)

在開始PBMC分離之前，需要進(jìn)行充分的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。以下是一些需要注意的事項(xiàng)

1.血液樣本的采集和處理

在進(jìn)行PBMC分離之前，需要采集血液樣本。采血時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn):首先，要選擇適當(dāng)?shù)牟裳獣r(shí)間，如清晨空腹采血可以提高檢測結(jié)果的穩(wěn)定性;其次，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)牟裳绞?，如靜脈采血或動(dòng)脈采血;最后，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)目鼓齽﹣硖幚硌簶颖荆员苊庋耗?。在采集血液樣本后，?yīng)盡快將樣本送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

2.實(shí)驗(yàn)器材和試劑的準(zhǔn)備

在實(shí)驗(yàn)前，需要準(zhǔn)備好所需的實(shí)驗(yàn)器材和試劑。應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)碾x心管、吸管、細(xì)胞篩等實(shí)驗(yàn)器材，并確保這些器材的清潔度和無菌狀態(tài)。此外，需要準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)姆蛛x介質(zhì)、洗滌液、培養(yǎng)基等試劑，并確保這些試劑的質(zhì)量和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。

將分離液的溫度平衡至室溫(RT)，避光。

樣品準(zhǔn)備：抗凝全血或骨髓。根據(jù)樣本濃度狀態(tài)，可適當(dāng)用生理鹽水稀釋，提高分離效果。

3.操作過程注意事項(xiàng)

在PBMC分離的操作過程中，應(yīng)注意以下事項(xiàng)

1.離心速度和時(shí)間的選擇

離心是PBMC分離的重要步驟之一。在選擇離心速度和時(shí)間時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)際情況進(jìn)行權(quán)衡。離心速度過高或時(shí)間過長可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷或失活；離心速度過低或時(shí)間過短則可能導(dǎo)致分離不充分。因此，需要根據(jù)分離介質(zhì)的特性和所需細(xì)胞類型進(jìn)行選擇和調(diào)整。

2.操作過程的無菌化處理

在PBMC分離過程中，應(yīng)保持操作的無菌化處理。所有實(shí)驗(yàn)器材和試劑應(yīng)保持清潔和無菌狀態(tài)，以避免污染和交叉感染。此外，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在無菌操作臺(tái)或超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，并穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備。

3.細(xì)胞的洗滌和處理

在離心后，需要對細(xì)胞進(jìn)行洗滌和處理。應(yīng)使用適當(dāng)?shù)南礈煲喝コs質(zhì)和死細(xì)胞，并輕輕拍打離心管底部以幫助細(xì)胞懸浮和去除雜質(zhì)。在洗滌過程中應(yīng)避免使用太大的力氣或過多的液體，以免影響細(xì)胞的活性或數(shù)量。處理后的細(xì)胞應(yīng)盡快進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或存儲(chǔ)。

PBMC細(xì)胞分離方法

1.取新鮮抗凝全血，按照1：1比例加入1×稀釋洗滌液，將血液進(jìn)行稀釋(以降低血液粘稠度)，輕柔混勻，備用。

2. 向無菌離心管內(nèi)加入適量的單個(gè)核細(xì)胞分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液液面上方(分離液：稀釋全血=1：2)，保持兩液面界面清晰。

3. 800g，室溫，離心 20min-30min(注：設(shè)置較慢的加速度和減速度，如果有十檔，設(shè)為第三檔)。

4. 離心結(jié)束后，吸棄血漿層，小心吸取PBMC層(即白膜層)并轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。離心結(jié)束后，管內(nèi)液面從上至下依次為稀釋血漿層、PBMC層、分離液層和紅細(xì)胞層(見圖1)。

圖稀釋外周血離心前后的分層狀態(tài)圖

5.向離心管中加入10mL 的1×稀釋洗滌液重懸細(xì)胞，250g，室溫離心 10min ，棄上清。重復(fù)該步驟 1~2 次，即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

6.細(xì)胞活力檢測：死的細(xì)胞可被染成藍(lán)色，活細(xì)胞不著色。計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞。計(jì)算出活細(xì)胞百分率?；罴?xì)胞百分率(%)=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)(%)。

7.細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml培養(yǎng)基，加于六孔板或24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。

8.細(xì)胞收集：將六孔板或二十四孔板中的培養(yǎng)基吸出棄掉，每孔加200μL Trizol，用移液槍將孔壁吹打數(shù)次后，將Trizol轉(zhuǎn)入EP管中。

9.細(xì)胞凍存：將收集的細(xì)胞放入-80℃冰箱中保存。

PBMC細(xì)胞分離注意事項(xiàng)

1.不同種屬動(dòng)物單個(gè)核細(xì)胞的比重有一定差異，請選擇合適的分離液進(jìn)行PBMC的分離。

2.血液新鮮程度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，請盡量使用采集后24h內(nèi)的血液進(jìn)行PBMC分離。

3.為保證細(xì)胞的活力，整個(gè)操作過程請輕柔，避免對細(xì)胞造成機(jī)械性的損傷。

4.為保持細(xì)胞狀態(tài)良好，請盡量縮短整個(gè)試驗(yàn)的周期。

5.離心后收獲細(xì)胞前，也可先吸取采集或丟棄最上層血漿層，有助于防止被血小板污染。

6. 離心后傾倒上清時(shí)不要將分離管倒置2s以上。

7.分離管請勿重復(fù)使用。