SW1990人胰腺癌細(xì)胞簡(jiǎn)介

人胰腺癌細(xì)胞SW1990是1978年從一II級(jí)胰腺癌的脾轉(zhuǎn)移中分離建系。可在裸鼠中成瘤。胰腺癌(Pancreatic carcinoma)主要指胰外分泌腺腺癌，是胰腺惡性腫瘤中最常見(jiàn)的一種，約占全身各種癌腫的1%～4%，占消化道惡性腫瘤的8%～10%。通常論及胰腺癌時(shí)也同時(shí)論及壺腹周?chē)?，前者為胰腺本身，后者則包括膽總管下端、壺腹、十二指腸乳頭及胰頭的癌，其惡性程度以胰腺癌為最高，其數(shù)量也以胰腺癌為最多，約占3/5。有報(bào)道該細(xì)胞只有29%的克隆形成率。

SW1990人胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱(chēng)：SW1990人胰腺癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱(chēng)：SW-1990; SW 1990; 人胰腺癌細(xì)胞

種屬來(lái)源：人

組織來(lái)源：胰腺

生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

致瘤性：Yes, forms tumors in nude mice

STR位點(diǎn)信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10,12;D2S1338：23;D3S1358：16;D5S818：12,13;D7S820：9,10;D8S1179：11,14;D13S317：8,12;D16S539：13;D18S51：13;D19S433：13,15;D21S11：31;FGA：26;PentaD：11;PentaE： 5,7;TH01：9.3;TPOX：8,9;vWA：17

保藏機(jī)構(gòu)：ATCC; CCTCC; CLS; KCB; Ubigene

培養(yǎng)基：90%L-15+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：100%空氣;溫度：37℃

凍存條件：無(wú)血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

SW1990人胰腺癌細(xì)胞形態(tài)特征

SW1990細(xì)胞形態(tài)特征上皮細(xì)胞樣，貼壁生長(zhǎng)，據(jù)報(bào)道該細(xì)胞集落形成率為29%。SW 1990[SW-1990，SW1990]細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和癌癥研究。

SW1990人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)操作說(shuō)明

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1.無(wú)菌環(huán)境：無(wú)菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：L-15培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無(wú)菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴75%酒精

SW1990細(xì)胞復(fù)蘇操作方法

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái)30min，提前打開(kāi)水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍?zhuān)?mL巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLSW1990細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機(jī)中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱(chēng)和細(xì)胞名稱(chēng)。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將SW1990細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà)30個(gè)8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定SW1990細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

SW1990細(xì)胞傳代操作方法

從培養(yǎng)箱拿出SW1990細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)SW1990細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

打開(kāi)廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸1ml移液槍移入無(wú)菌離心管中。

將裝有SW1990細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫(huà)“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫(huà)30個(gè)8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

7)確定SW1990細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

SW1990人胰腺癌細(xì)胞傳代小貼士

SW1990細(xì)胞培養(yǎng)不能通入CO2，如果沒(méi)有條件準(zhǔn)備空氣氣相100% 的培養(yǎng)箱，可以采用不透氣密封蓋的T25培養(yǎng)瓶來(lái)培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每天將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱換1-2次空氣。

SW1990人胰腺癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出SW1990細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá)80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25瓶為例

SW1990細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，裝入無(wú)菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，在SW1990細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱(chēng)、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80度凍存盒里，放置24小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

SW1990人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題

SW1990細(xì)胞用什么培養(yǎng)基

SW1990細(xì)胞培養(yǎng)基90%L-15+10%FBS+PS。

sw1990細(xì)胞消化時(shí)間

SW1990細(xì)胞不好消化，放培養(yǎng)箱8-10分鐘，1990本身就是很多空泡存在的，一般難消化的細(xì)胞對(duì)胰酶不敏感，很難過(guò)度消化，除非很夸張那種十幾二十分鐘半個(gè)小時(shí)，不同胰酶品牌消化時(shí)間存在差異，所以以實(shí)際為準(zhǔn)。

SW1990人胰腺癌細(xì)胞應(yīng)用

SW 1990可以用于姜黃素增強(qiáng)吉西他濱抗胰腺癌的機(jī)制研究

研究是基于腫瘤增殖,遷移及侵襲探討姜黃素是否可在體內(nèi)外增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究,為臨床治療胰腺癌提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方法

1.Western blot法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1,BxPC-3,Panc-1和SW1990中Id1蛋白表達(dá);應(yīng)用CCK8法獲得姜黃素、吉西他濱的IC50值,檢測(cè)姜黃素和/或吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響;Compusyn軟件分析姜黃素與吉西他濱的協(xié)同指數(shù),確定兩者在聯(lián)合用藥中的劑量;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素和/或吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)姜黃素和/或吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響;Western blot法檢測(cè)姜黃素和/或吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表達(dá)水平的影響;

2. 應(yīng)用CCK8法獲得Srcinhibitor 1(Src-I1)的IC50值,檢測(cè)Src-I1對(duì)胰腺癌胰腺癌細(xì)胞增殖的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Src-I1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響,Western blot法檢測(cè)Src-I1對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表達(dá)水平的影響;構(gòu)建Id1過(guò)表達(dá)(AsPC-1-Id1)及敲減細(xì)胞株(SW1990-shId1),qRT-PCR檢測(cè)Id1 mRNA表達(dá)水平。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)及敲減Id1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)及敲減Id1對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Id1蛋白表達(dá)水平的影響;

3. 體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞AsPC-1和SW1990,分為對(duì)照組,TGF-β1組,TGF-β1+姜黃素組,TGF-β1+吉西他濱組,以及TGF-β1+姜黃素+吉西他濱組;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響;Western blot法檢測(cè)藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表達(dá)水平的影響;

4. 構(gòu)建胰腺癌細(xì)胞SW1990裸鼠皮下移植瘤模型,分為對(duì)照組,姜黃素組,吉西他濱組,以及姜黃素+吉西他濱組;觀察藥物在體內(nèi)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響;TUNEL檢測(cè)藥物對(duì)裸鼠移植瘤凋亡的影響;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)藥物對(duì)裸鼠移植瘤中Id1,E-cadherin及Ki-67表達(dá)水平的影響;Western blot法檢測(cè)藥物對(duì)裸鼠移植瘤中凋亡相關(guān)蛋白(Bax,Bcl-2,Caspase-3),EMT相關(guān)蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表達(dá)水平的影響。

結(jié)果

1.在胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1,BxPC-3,Panc-1和SW1990中,SW1990細(xì)胞中Id1蛋白表達(dá)最高,AsPC-1細(xì)胞中表達(dá)最低;體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,姜黃素與吉西他濱有協(xié)同效應(yīng),相較于單獨(dú)應(yīng)用姜黃素或者吉西他濱,姜黃素可顯著增強(qiáng)吉西他濱在胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲方面的抑制作用;并且姜黃素增強(qiáng)了吉西他濱下調(diào)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)MMP9,SNAIL,Id1,p-Src蛋白的表達(dá),同時(shí)上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)的能力;

2. Src-I1顯著抑制了胰腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力,并顯著降低了胰腺癌細(xì)胞株中的Id1及p-Src蛋白表達(dá);慢病毒構(gòu)建的Id1過(guò)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞株中,Id1 mRNA顯著上調(diào),Id1,MMP9及SNAIL蛋白表達(dá)顯著上調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào);在慢病毒構(gòu)建的Id1敲減胰腺癌細(xì)胞株中,Id1 mRNA顯著下調(diào),Id1,MMP9及SNAIL蛋白表達(dá)顯著下調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào);Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)Id1敲減后胰腺癌癌細(xì)胞SW1990侵襲力顯著減弱;相反,Id1過(guò)表達(dá)胰腺癌細(xì)胞AsPC-1侵襲力顯著增強(qiáng);

3.姜黃素和/或吉西他濱可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力;胰腺癌細(xì)胞經(jīng)TGF-β1作用后,MMP9,SNAIL,Id1及p-Src蛋白表達(dá)相較于對(duì)照組顯著上調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)顯著下調(diào),后經(jīng)姜黃素、吉西他濱、姜黃素+吉西他濱處理后,MMP9,SNAIL,Id1及p-Src蛋白表達(dá)相較于TGF-β1處理的胰腺癌細(xì)胞顯著下調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)顯著上調(diào);與單獨(dú)應(yīng)用姜黃素或吉西他濱相比,姜黃素+吉西他濱組顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞侵襲,下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的胰腺癌內(nèi)MMP9,SNAIL,Id1及p-Src蛋白表達(dá),以及上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)的能力。

用于蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用研究

采用侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990為靶細(xì)胞,初步探討PAR-2促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的可能的分子機(jī)制。

方法:RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)SW1990細(xì)胞中PAR-2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。繪制SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,MTT法檢測(cè)胰蛋白酶和PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV作用前后SW1990細(xì)胞增殖情況,并確定合適的各藥物濃度和作用時(shí)間。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布。Transwell小室法檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲和遷移能力。RT-PCR法檢測(cè)胰藥物作用前后MMP-2、MMP-9、VEGF-A、VEGF-C、IL-8 mRNA表達(dá)的變化。

明膠酶譜法檢測(cè)胰蛋白酶和SLIGKV作用細(xì)胞前后MMP-2、MMP-9明膠酶活性的變化。ELISA法檢測(cè)藥物干預(yù)SW1990細(xì)胞8h、16h、24h、32h后分別收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液,檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的各個(gè)時(shí)間段上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8的蛋白含量變化。結(jié)果:PAR-2在胰腺癌細(xì)胞SW1990細(xì)胞中高表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]The Akt expression correlates with the VEGF-A and-C expression as wellas the microvessel and lymphatic vessel density in breast cancer[J].Shinichi Tsutsui,Ayumi Matsuyama,Manabu Yamamoto,Hideya Takeuchi,Yumi Oshiro,Teruyoshi Ishida,Yoshihiko Maehara.Oncology Reports.2010(3)

[2]Dual effect of the novel peptide antagonist K‐14585 on proteinase‐activated receptor‐2‐mediated signalling[J].Fui GoonGoh,Pei YuenNg,MaryNilsson,ToruKanke,RobinPlevin.British Journal of Pharmacology.2009(7)

[3]Vascular Endothelial Growth Factors,Angiogenesis,and Survival in Human Ileal Enterochromaffin Cell Carcinoids[J].Besig,Sophie,Voland,Petra,Baur,Dorothee M,Perren,Aurel,Prinz,Christian.Neuroendocrinology.2009(4)

[4]Novel antagonists for proteinase‐activated receptor 2:inhibition of cellular and vascular responses in vitro and in vivo[J].TKanke,MKabeya,SKubo,SKondo,KYasuoka,JTagashira,HIshiwata,MSaka,TFuruyama,TNishiyama,TDoi,YHattori,AKawabata,MRCunningham,RPlevin.British Journal of Pharmacology.2009(1)

[5]段澤星.蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2011.