OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞背景簡(jiǎn)介

OCM-1A細(xì)胞系，人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞具有高度增殖能力和侵襲性，能夠迅速擴(kuò)散到周圍組織和遠(yuǎn)處器官。因此，它被廣泛用于評(píng)估抗腫瘤藥物的療效和毒性，以及開發(fā)新型的抗腫瘤治療方法。此外，OCM-1A細(xì)胞系也被用于研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，以及探索新的靶點(diǎn)和治療方法。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞

細(xì)胞別稱：OCM1A; OCM1a; 人低侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤

種屬來源：人

組織來源：皮膚

形態(tài)特性：貼壁生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞樣

STR位點(diǎn)信息：Amelogenin：X;CSF1PO：11;D2S1338：19;D3S1358：14,16;D5S818：11,12;D7S820：8,10;D8S1179：13;D13S317：12;D16S539：9;D18S51：13,18;D19S433：14,15;D21S11：30;FGA：21;TH01：6,7;TPOX：8,11;vWA：18

保藏機(jī)構(gòu)：cancercelllines; CVCL_6935

培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲(chǔ)存

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)操作方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實(shí)驗(yàn)室條件

1.無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)-操作平臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級(jí)水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無菌操作：洗手，戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服，常噴75%酒精

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺(tái)30min，提前打開水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺(tái)常溫放30min)。在操作臺(tái)上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到37℃時(shí)，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLOCM-1A細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機(jī)中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺(tái)內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個(gè)新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將OCM-1A細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫30個(gè)8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定OCM-1A細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動(dòng))，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞傳代方法

從培養(yǎng)箱拿出OCM-1A細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)OCM-1A細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到85%左右的時(shí)候即可進(jìn)行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個(gè)藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動(dòng)以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)以便胰酶浸泡到每個(gè)細(xì)胞，消化1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個(gè)角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時(shí)盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對(duì)細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸1ml移液槍移入無菌離心管中。

將裝有OCM-1A細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個(gè)黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺(tái)上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺(tái)子上畫30個(gè)8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測(cè)是否鋪勻細(xì)胞。

確定OCM-1A細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動(dòng))。第二天再觀察細(xì)胞密度。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

從培養(yǎng)箱拿出OCM-1A細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá)80–90%時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25瓶為例

細(xì)胞凍存步驟

a.收集OCM-1A細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b.根據(jù)OCM-1A細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，在OCM-1A細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫(kù)到-80度凍存盒里，放置24小時(shí)后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫(kù)位置和凍存日期。

OCM-1A人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞應(yīng)用

OCM-1A細(xì)胞系|人脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞可以用于miR-200c/Zeb1負(fù)反饋回路對(duì)眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及成瘤性的作用

研究microRNA-200c與Zeb1構(gòu)成的雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)通道對(duì)眼內(nèi)惡性腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、成瘤能力及遷徙轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控作用。

方法

①miR-200c對(duì)眼內(nèi)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及遷徙能力的調(diào)控。①建立miR-200c過表達(dá)及表達(dá)抑制的細(xì)胞模型。應(yīng)用miR-200c的模擬物和抑制劑對(duì)人眼脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞株OCM-1、人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株WERI-RB1和Y79進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,在三個(gè)細(xì)胞株中建立miR-200c過表達(dá)及表達(dá)抑制的細(xì)胞模型。通過對(duì)miR-2O0c載體所攜帶的FAM熒光對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)情況進(jìn)行熒光顯微鏡下的肉眼觀察,初步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)染前后各株細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)一步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

②miR-200c對(duì)其靶基因——上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的重要轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的調(diào)節(jié)作用。使用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡法及免疫熒光等分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)OCM-1、WERI-RB1和Y79細(xì)胞miR-200c轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)的Zeb1因子在mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),以驗(yàn)證miR-200c在眼內(nèi)腫瘤對(duì)Zebl的調(diào)控作用。

③miR-200c對(duì)眼內(nèi)腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控。使用實(shí)時(shí)定量PCR、免疫印跡法及免疫熒光等分子生物學(xué)檢測(cè)方法,對(duì)三個(gè)細(xì)胞株miR-200c轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)上皮標(biāo)記因子E-cadherin、間質(zhì)標(biāo)記因子Vimentin和N-cadherin分別進(jìn)行不同表達(dá)水平的定性、定量和定位,以檢驗(yàn)miR-200c對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子的調(diào)控作用。

④miR-200c對(duì)眼內(nèi)腫瘤細(xì)胞體外遷徙能力的調(diào)控。利用Transwell小室對(duì)OCM-1和Y79細(xì)胞各組(未轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照轉(zhuǎn)染組、模擬物WERI-RB1轉(zhuǎn)染組、抑制劑轉(zhuǎn)染組)進(jìn)行體外透膜遷徙能力檢測(cè),以評(píng)估的表達(dá)干擾對(duì)眼內(nèi)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的作用。

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