CNE2人鼻咽癌細(xì)胞背景介紹

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞，來源于低分化鱗狀癌細(xì)胞，是一種EB病毒(EBV)呈陰性的鼻咽癌(NPC)細(xì)胞系，最初認(rèn)為起源于一名患有鼻咽癌的68歲男性，患者鼻咽部脫落細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)檢查和抗補(bǔ)體免疫酶檢測分別顯示低分化癌和EB核抗原陽性(EBNA)。

因此CNE-2最初被認(rèn)為是EBV陽性，可能在后續(xù)傳代培養(yǎng)過程發(fā)生了EBV基因組丟失。之后有研究發(fā)現(xiàn)CNE-1和CNE-2的STR譜之間存在高度相似性，推測它們應(yīng)該來自同個細(xì)胞系，并且兩株細(xì)胞均存在部分HeLa的基因組，似乎為HeLa和未知來源細(xì)胞系的雜交種。

CNE-2常用于鼻咽癌相關(guān)的分子機(jī)制研究，有研究報道了一種新的“細(xì)胞內(nèi)感染”機(jī)制，被EBV感染的Akata B細(xì)胞能夠在體外入侵上皮CNE-2細(xì)胞,形成“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致CNE-2細(xì)胞中出現(xiàn)EBV的基因表達(dá)和病毒顆粒。

CNE-2為上皮細(xì)胞樣，貼壁生長，是一個合適的轉(zhuǎn)染宿主。CNE-2的染色體數(shù)在87~107，并有許多標(biāo)記染色體，其中包含兩個巨大的染色體M1和M2。由于M1和M2是低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞系中第一個被發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記染色體，它們的條帶模式很明確，能引導(dǎo)更多科研工作者對鼻咽癌細(xì)胞系的遺傳學(xué)研究。

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞形態(tài)

CNE-2為上皮細(xì)胞樣，貼壁生長，是一個合適的轉(zhuǎn)染宿主，常用在鼻咽癌相關(guān)研究方面。

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)品信息

細(xì)胞名稱：CNE2人鼻咽癌細(xì)胞

細(xì)胞別稱：CNE-2; CNE2;人鼻咽癌細(xì)胞

種屬來源：人

組織來源：鼻

生長特性：貼壁生長

細(xì)胞形態(tài)：上皮細(xì)胞樣

STR位點信息：Amelogenin：X;CSF1PO：10,11;D2S1338：17,23;D3S1358：15,18;D5S818：11,12;D7S820：10,12;D8S1179：12,17;D13S317：10,12,13.3;D16S539：9,10;D18S51：13,16;D19S433：13;D21S11：27,30;FGA：18,21;TH01：6,7,9;TPOX：8,9,12;vWA：14,16

保藏機(jī)構(gòu)：CCTCC; GDC0155

培養(yǎng)基：90%DMEM+10%FBS+PS

培養(yǎng)條件：氣相：95%空氣+5%二氧化碳;溫度：37℃

凍存條件：無血清凍存液，液氮儲存

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)操作方法

細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

實驗室條件

1.無菌環(huán)境：無菌室包括更衣室，緩沖間，風(fēng)淋間，操作間

2.儀器設(shè)備：超凈工作臺-操作平臺、CO2培養(yǎng)箱-細(xì)胞生長的環(huán)境、倒置顯微鏡-觀察細(xì)胞、離心機(jī)-離心收集細(xì)胞、冰箱-放置培養(yǎng)基等試劑、水浴鍋-復(fù)蘇細(xì)胞、真空泵-收集廢液、滅菌鍋-滅菌、干燥箱-烘干器材、液氮罐-凍存細(xì)胞、純水儀-制備一級水

3.器材耗材：玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、巴士管、離心管、移液槍、槍頭(白色0-10ul;黃色20-200ul;藍(lán)色100-1000ul)、濾器，吸管，多孔培養(yǎng)皿、6cm皿、10cm皿，培養(yǎng)瓶等。

4.試劑：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、雙抗、胰酶(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)、pbs

操作者工作范疇

1.無菌操作：洗手，戴手套，穿實驗服，常噴75%酒精

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞復(fù)蘇步驟

1)準(zhǔn)備：紫外線照臺30min，提前打開水浴鍋設(shè)置37℃，培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘(或者放在超凈工作臺常溫放30min)。在操作臺上擺放好物品，左邊放完全培養(yǎng)液，1mL槍頭(已滅菌)，培養(yǎng)皿，右上角放廢液缸，1mL移液槍，3mL巴氏管。檢查離心機(jī)，廢液泵。

2)待水浴鍋溫度達(dá)到37℃時，戴上手套和護(hù)目鏡，從-196℃液氮罐中取出凍存管，將含有1mLCNE2細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，同時不斷輕輕搖動凍存管，盡量保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化，加4mL培養(yǎng)基混合均勻，移入離心機(jī)中100rpm離心3min，以75%酒精噴凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3)用3mL巴氏管取5mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的6cm培養(yǎng)皿中，(若離心后細(xì)胞量較多，可取12mL新鮮培養(yǎng)基到一個新的10cm培養(yǎng)皿中)，標(biāo)記日期、所用培養(yǎng)基名稱和細(xì)胞名稱。

4)用廢液泵(吸力不要太大)取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將CNE2細(xì)胞懸液加入到培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

5)確定CNE2細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱過夜。(盡量平直放入不要晃動)，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞傳代操作

從培養(yǎng)箱拿出CNE2細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)CNE2細(xì)胞狀態(tài)良好，且密度達(dá)到85%左右的時候即可進(jìn)行傳代;

打開廢液泵，用廢液泵吸頭(吸力不要太大)取一個藍(lán)色槍頭吸走上清廢液，用巴士管取4ml不含鈣、鎂離子的1xPBS(6cm皿)到細(xì)胞培養(yǎng)皿中(若是10cm皿則取8ml1xPBS)，輕輕晃動以清洗細(xì)胞表面1-2次;

用廢液泵吸走PBS廢液，加1mL消化液(0.25%Trypsin-0.02%EDTA)于培養(yǎng)瓶中，拿起培養(yǎng)皿輕輕轉(zhuǎn)動以便胰酶浸泡到每個細(xì)胞，消化1-3min(根據(jù)細(xì)胞貼壁情況判斷，貼壁較牢的消化時間長一點或者放入CO2培養(yǎng)箱中消化幾分鐘)后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓變亮，一旦發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，即將脫離培養(yǎng)皿底，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

用1ml移液槍輕柔吹打，保證培養(yǎng)皿底的每個角落都吹打到，邊緣處也不能忽略(吹打時盡量避免產(chǎn)生氣泡，因其對細(xì)胞有傷害;需輕柔吹打，用力吹打?qū)?xì)胞也有傷害)，把培養(yǎng)瓶中所有細(xì)胞懸液用吸1ml移液槍移入無菌離心管中。

將裝有CNE2細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)中(配平)，1000轉(zhuǎn)離心3-5min，用廢液泵取一個黃色槍頭從凍存管中吸走上清，取1-2mL新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后(充分混勻)，將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，將培養(yǎng)皿在超凈工作臺上以畫“8”字法鋪勻細(xì)胞(一般培養(yǎng)皿在臺子上畫30個8字即可鋪勻)，最后在顯微鏡下檢測是否鋪勻細(xì)胞。

確定CNE2細(xì)胞已鋪勻后，再把培養(yǎng)皿放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(盡量平直放入不要晃動)。第二天再觀察細(xì)胞密度。

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞凍存準(zhǔn)備

1)準(zhǔn)備工作：紫外線照臺30min，準(zhǔn)備好CNE2細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑物品：培養(yǎng)液，胰酶，PBS(試劑提前拿出37℃預(yù)熱或者常溫放置半小時以上);傳代用培養(yǎng)皿，巴士管，離心管(已滅菌)，槍頭(已滅菌)，移液槍，廢液缸。檢查離心機(jī)，廢液泵;

2)從培養(yǎng)箱拿出CNE2細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度和細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好且存活率高的狀態(tài)下，細(xì)胞密度達(dá)80–90%時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存操作，以T25瓶為例

CNE2細(xì)胞凍存步驟

a.收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶內(nèi)所有培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入無菌離心管，裝入無菌離心管中，1000rpm條件下離心4min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

b.根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，在CNE2細(xì)胞凍存管上貼上細(xì)胞標(biāo)簽(細(xì)胞標(biāo)簽上包含：細(xì)胞名稱、凍存日期、培養(yǎng)用的培養(yǎng)基)。

c.將凍存管入庫到-80度凍存盒里，放置24小時后，即可移入液氮中保存，標(biāo)記好入庫位置和凍存日期。

CNE2人鼻咽癌細(xì)胞應(yīng)用

人鼻咽癌細(xì)胞是一種來源于人類鼻咽癌組織的惡性細(xì)胞。這些細(xì)胞在實驗室條件下可以進(jìn)行培養(yǎng)和研究，以深入了解鼻咽癌的生物學(xué)特性、發(fā)生機(jī)制以及潛在的治療方法。

人鼻咽癌細(xì)胞的研究對于理解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理、預(yù)防和治療策略的制定具有重要意義。通過對這些細(xì)胞的研究，科學(xué)家們可以探索鼻咽癌細(xì)胞的生長、增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性等特性，以及尋找新的治療靶點和藥物。

在實驗室中，人鼻咽癌細(xì)胞通常通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)和繁殖。科學(xué)家們使用特定的培養(yǎng)基和條件，模擬體內(nèi)的環(huán)境，以促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。通過這些細(xì)胞培養(yǎng)實驗，可以觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長速度、對藥物的敏感性等指標(biāo)，以評估鼻咽癌的生物學(xué)特性和治療效果。

人鼻咽癌細(xì)胞可以用于蘆薈大黃素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖、凋亡及周期的影響

將不同濃度的蘆薈大黃素(aloe-emodin,AE)作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE2,通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測蘆薈大黃素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖、凋亡及周期分布的影響,為蘆薈大黃素的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

方法

通過MTT法(又稱MTT比色法)和流式細(xì)胞術(shù)等體外實驗觀察不同濃度蘆薈大黃素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖、凋亡及周期分布的影響。

(1) MTT法:將不同濃度的蘆薈大黃素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE2,分別培養(yǎng)24h,48h,72h,觀察蘆薈大黃素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖的影響。

(2) 流式細(xì)胞術(shù):將不同濃度的蘆薈大黃素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE2 48h,觀察蘆薈大黃素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE2凋亡和周期分布的影響。

結(jié)果

(1)MTT法:不同濃度的蘆薈大黃素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE2 24h,48h,72h后,細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度和作用時間的增加也相應(yīng)增加,并在40ug/ml時達(dá)到平臺期,各實驗組與空白組相比P<0.05,具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明:蘆薈大黃素在(2.5ug/ml40ug/ml)時能抑制人鼻咽癌細(xì)胞CNE2的增殖,并呈時間和濃度依賴性。

(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:將不同濃度的蘆薈大黃素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE2 48h,實驗結(jié)果顯示:隨著藥物濃度的增加,凋亡率從1.153%依次增加至3.753%,與空白組相比P<0.05,具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。表明蘆薈大黃素作用48h時,人鼻咽癌細(xì)胞CNE2凋亡率明顯增加,并呈濃度依賴性。

(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期:將不同濃度的蘆薈大黃素(0ug/ml,2.5ug/ml,5ug/ml,10ug/ml,20ug/ml,40ug/ml)作用于人鼻咽癌細(xì)胞CNE2 48h,實驗結(jié)果顯示:在G2/M期,與AE0ug/ml組相比,其余各組G2/M期細(xì)胞比例均明顯增加。表明蘆薈大黃素作用48h時,能將人鼻咽癌細(xì)胞CNE2周期阻滯在G2/M期。

結(jié)論

1.蘆薈大黃素能抑制人鼻咽癌細(xì)胞CNE2的增殖,并呈時間和濃度依懶性。

2. 蘆薈大黃素作用48h時,人鼻咽癌細(xì)胞CNE2的凋亡率從整體上看凋亡基數(shù)不高,但是仍具有依次增加的趨勢,尤其是早期凋亡率具有顯著的濃度依賴性。

3.蘆薈大黃素作用48h時,能將人鼻咽癌細(xì)胞CNE2周期阻滯在G2/M期。

參考文獻(xiàn)

[1]Chemical constituents of Aloe barbadensis Miller and their inhibitory effects on phosphodiesterase-4D[J].Jiasheng Zhong;;Yiyou Huang;;Wenjing Ding;;Xiaofang Wu;;Jinzhi Wan;;Haibin Luo.Fitoterapia,2013

[2]Dietary Aloe vera components’effects on cholesterol lowering and estrogenic responses in juvenile goldfish,Carassius auratus[J].Francesco A.Palermo;;Paolo Cocci;;Mauro Angeletti;;Alberto Felici;;Alberta Maria Polzonetti-Magni;;Gilberto Mosconi.Fish Physiology and Biochemistry,2013(4)

[3]The Effect of an Aloe Polymannose Multinutrient Complex on Cognitive and Immune Functioning in Alzheimer's Disease[J].John E.Lewis;;H.Reginald McDaniel;;Marc E.Agronin;;David A.Loewenstein;;Jorge Riveros;;Rafael Mestre;;Mairelys Martinez;;Niurka Colina;;Dahlia Abreu;;Janet Konefal;;Judi M.Woolger;;Karriem H.Ali.Journal of Alzheimer's Disease,2012

[4]Antiviral activity of Aloe hijazensis against some haemagglutinating viruses infection and its phytoconstituents[J].Howaida Abd-Alla;Nagat Abu-Gabal;Amal Hassan;Mounir El-Safty;Nagwa Shalaby.Archives of Pharmacal Research,2012(8)

[5]趙焱麗.蘆薈大黃素對人鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖、凋亡及周期的影響[D].河南中醫(yī)藥大學(xué),2018.